短发夹状RNA抑制RhoA基因在HepG2细胞中的表达

目的构建针对人RhoA基因的短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达载体,观察其对人肝癌细胞株HepG2 RhoA表达的特异性抑制效应。方法设计合成针对RhoA mRNA编码序列两个不同靶点的核苷酸片断,并定向克隆到真核表达载体Pgenesil-2的U6启动子下,构建重组质粒phsRNA-RhoA1和pshRNA-RhoA2,不针对任何基因组序列的重组质粒pshRNA-HK作为阴性对照。脂质体法转染到HepG2细胞后,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)分别检测RhoA基因表达的抑制效应。结果酶切鉴定和测序结果证实重组质粒均构建成功。转染HepG2后,pshRNA-RhoA2组RhoA基因mRNA和蛋白的表达水平均显著降低,与pshRNA-HK组和空白细胞组相比,差异有统计学意义(r=-19.28,t=-7.08,P<0.05)。而pshRNA-RhoA1组抑制效应不明显,差异无统计学意义(r=-0.16,t=-0.30,P>0.05)。结论构建的重组质粒pshRNA-RhoA2能特异有效地抑制RhoA基因在肝癌细胞HepG2中的表达,为进一步研究RhoA基因在肝癌中的作用提供了有效的分子工具。     

短发夹状RNA对人肝癌细胞环氧合酶-2的抑制作用

目的:构建针对人环氧合酶-2(COX-2)基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒,观察其在不同时间点对人不同肝癌细胞株COX-2表达的影响.方法:以人COX-2mRNA编码区作为RNA干扰靶点,构建shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,应用阳离子脂质体分别转染人肝癌细胞株HepG2和Bel7402,利用逆转录聚合酶链反应和Westernblot法分别观察两株细胞转染后24,48,72,和96hCOX-2mRNA和蛋白的表达变化,检测抑制效果.结果:质粒在HepG2细胞和Bel7402细胞中的转染率分别约为60%和54%.WBH1导入细胞24,48,72和96h后,逆转录聚合酶链反应检测COX-2mRNA表达抑制率,HepG2细胞分别为18.5%,88.6%,52.8%和42.4%(P<0.01).Bel7402细胞分别为9%,45.1%,70.1%和56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.     

短发夹状RNA干扰窖蛋白-1表达对人肝细胞增殖的影响

目的 探讨体外下调窖蛋白-1(Cav-1)的表达对人肝细胞增殖的影响.方法 构建Cav-1特异性短发夹状RNA(shRNA)表达载体psiRNA-CAV1,转染人正常肝细胞系(CHL),抗菌素Zeocin筛选单克隆细胞株,建立Cav-1低表达的人肝细胞模型(CAV7).四甲基偶氮唑盐法检测Cav-1下调对肝细胞增殖的影响,Western blot检测Erk1/2和Akt等增殖生长相关信号蛋白表达和活性的变化. 结果 正常肝细胞有高水平的Cav-1表达,稳定转染psiRNA-CAV1后,Cav-1表达减少约70%;Cav-1表达下调后,肝细胞的增殖先变快(24 h和72 h,P＜0.05;96 h,P＜0.01),后减慢;增殖相关蛋白p-Akt和p-Erk1/2的表达减少,即Akt和Erk1/2两条通路受到抑制. 结论 Cav-1可能在正常肝细胞的增殖中起重要作用.     

短发夹状RNA抑制SMYD3基因在HepG2细胞中的表达

目的构建针对人SET-和MYND-结构域含有蛋白3(SMYD3)基因的短发夹状RNA (shRNA)表达载体pGenesil-1-s,观察其对人肝癌细胞株HepG2细胞SMYD3基因表达的特异性抑制效应。方法设计合成针对SMYD3 mRNA编码序列267～288、302～323靶位点之间的核苷酸片断,并定向克隆到仅表达EGFP的空载体pGenesil-1的U6启动子下,构建重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2；不针对任何序列的重组质粒pGenesil-1-hk作为对照。通过脂质体介导转染人肝癌细胞株HepG2,应用逆转录聚合酶链反应,western blot蛋白免疫印迹法分别从mRNA、蛋白水平检测阻抑效应。结果酶切鉴定和测序结果证实了pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2、pGenesil-1-hk的成功构建,转染HepG2细胞后,pGenesil-1- s1、pGenesil-1-s2组SMYD3 mRNA和蛋白表达均明显下调,与pGenesil-1-hk组及pGenesil-1对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论构建的重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2能特异性抑制SMYD3 在HepG2细胞中的表达。     

短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响

目的:研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建特异性针对胰腺癌PANC-1细胞突变型K-ras基因的重组质粒pGensil-1-P1,阴性对照质粒pGensil-1-HK并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.并建立人胰腺癌细胞PANC-1裸鼠皮下移植瘤模型,分别注射Pgenesil-1-P1、Pgenesil-1-HK质粒,动态观察并处死裸鼠计算肿瘤体积.结果:测序证实质粒表达载体构建成功,短发夹RNA(shRNA)使胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因的mRNA较未治疗组、阴性对照组相比明显减少(P=0.01);未治疗组、阴性对照组及治疗组的K-ras蛋白表达率分别为100%,99.0%±0.73%,39.9%±2.1%,前两组K-ras蛋白表达差异无统计学意义,治疗组较未治疗组K-ras蛋白表达下调了约60.1%;细胞生长受到明显抑制(P=0.02);经重组质粒治疗14 d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小(P=0.03).结论:shRNA对特异性转染组的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞以及裸鼠移植瘤的生长受到抑制.     

靶向Pokemon基因shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞生长的影响

目的:观察携带shRNA的重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制.方法:设计3对针对Pokcmon基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体,脂质体介导转染肝癌细胞株HepG2细胞.RT-PCR及Western blot检测转染前后Pokemon mRNA及蛋白质的 表达,MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖及凋亡的变化,RT-PCR检测其可能的下游因子β-catenin及H-ras的表达.结果:成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pshRNA1、2、3.转染HepG2细胞后,Pokemon基因的mRNA及蛋白质表达水平明显下调,以pshRNA2最强,抑制率分别为75.2%(RNA水平)和72.6l%(蛋白质水平).MTT显示pshRNA2可明显抑制细胞增殖;流式细胞仪测定转染后细胞凋亡增加;RT-PCR显示下游因子H-ras的表达明显降低(P＜0.05),而β-catenin的表达没有变化(P＞0.05).结论:采用RNAi技术可以特异性阻断Pokemon 基因的表达;Pokemon基因有促进肝癌细胞株增殖及抑制其凋亡的作用,该效应可能与下调其下游因子H-ras的表达有关.     

短发夹状双链RNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

目的研究载体表达的短发夹状双链RNA（shRNA）对丙型肝炎病毒（HCV）IRES介导的基因表达的特异性抑制作用。方法构建HCV IRES调控的绿色荧光蛋白表达载体（pIRES—GFP）和虫荧光索酶表达载体（p5′ UTR—Luc），以及针对HCV IRES的shRNA表达载体（pshRNA-HCV）。共转染HepG2细胞，于转染后24、48、72h观察绿色荧光的强弱，用Western blot检测绿色荧光蛋白的表达，半定量逆转录聚合酶链反应法检测GFP的mRNA水平。双荧光索酶系统检测虫荧光索酶活性。结果pshRNA-HCV作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，GFP蛋白表达量及虫荧光素酶活性降低60％～70％，半定量逆转录聚合酶链反应显示pshRNA-HCV导致了GFP基因mRNA水平的降低。结论针对HCV IRES的shRNA能够显著和特异地抑制该区域调控的蛋白表达水平及mRNA水平，该研究结果为利用RNA干扰技术治疗HCV感染进行了初步探索。     

RNA介导survivin基因沉默对肝癌细胞HepG2细胞株凋亡及增殖的影响

目的观察靶向封闭survivin基因对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响,探讨survivin基因在肝癌的发生、发展中的作用。方法设计1对survivin-siRNA,体外转录制备siRNA。应用脂质体转染技术将survivin-siRNA转染肝癌细胞株HepG2,应用有荧光标记的非特异性小分子siRNA检测转染效率;RT-PCR检测survivin-mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测survivin蛋白表达情况;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪分析细胞凋亡。结果转染survivin-siRNA可使HepG2细胞survivin-mRNA水平下降53.8%,并可使survivin蛋白表达明显减少;转染survivin-siRNA对细胞增殖及细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论抑制survivin表达对肝癌细胞株HePG2凋亡及增殖无明显影响。提示survivin在肝癌细胞增殖与调亡调控中所起的作用可能并非是关键性的。     

Bax基因过表达诱导肝癌细胞凋亡

ｂｃｌ 2及其同源类似物是凋亡调节因子中最重要的家族之一。ｂｃｌ 2家族蛋白能通过多种方式调节细胞死亡途径 :(1)与其他ｂｃｌ 2家族成员二聚化形成同源或异源二聚体 ,且可能通过相互作用改变细胞生与死平衡 ;(2 )与非同源性蛋白结合 ;(3)形成离子通道或孔洞[1] 。Ｂａｘ基因是ｂｃｌ 2家族中的一员 ,与ｂｃｌ 2家族其他成员的氨基酸同源性主要表现在高度保守的ＢＨ1和ＢＨ2 结构域。人Ｂａｘ基因位于第 19号染色体 ,ｑ13 .3～ｑ13 .4内[2 ] 。Ｂａｘ过表达能对抗ｂｃｌ 2抑制细胞死亡的活性 ,在促凋亡因素刺激下 ,ｂｃｌ 2 /Ｂａｘ比值…     

应用RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制和表达

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)引发的序列特异性基因沉默机制。在这一转录后基因沉默(PTGS)过程中,与双链RNA有同源序列的单链RNA(如mRNA)被降解,从而阻断基因表达。RNAi过程的关键是由双链RNA     

Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统变化,激酶活性检测方法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化。结果 脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后Ⅰ～Ⅵ组(空白对照、正义对照、400、600、800、1000ng/ml反义转染组)细胞内p38MAPK活性分别为7.03、7.07、13.47、16.37、43.97及47.87;caspase-3活性分别为0.015±0.010、0.014±0.002、0.026±0.003、0.042±0.001、0.093±0.001及0.100±0.001;Ⅳ～Ⅵ组细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高。转染后细胞发生G_2/M期阻滞,Ⅰ～Ⅵ组细胞凋亡率分别为0.70％、0.76％、2.43％、7.82％、23.11％及31.35％,各实验组细胞凋亡较对照组明显增加。细胞内微丝形态结构破坏,Ⅰ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度分别为189.69±6.68、184.23±8.76、173.14±8.15、99.48±6.57、76.69±10.05及63.80±6.79,Ⅳ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度较对照组明显降低。结论 脂质体介导转染survivi     

人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制

目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.     

小干扰RNA干扰高迁移率族蛋白1对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和凋亡的影响. 方法设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNAH1、siRNH2、siRNAH3),同时设未转染对照组(Lipo组)及转染阴性siRNA组(阴性siRNA对照组).脂质体法瞬时转染HepG2细胞,通过PCR法和Western blot检测细胞中HMGB1基因在mRNA水平和蛋白质水平的变化,利用四甲基偶氮唑盐法检测转染HMGB1-siRNA的HepG2细胞增殖情况,TdT酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.两组数据间比较用t检验,组内数据比较用方差分析,细胞增殖数据采用可重复双因素方差分析.结果 3对特异性HMGB1-siRNA转染后,HMGB1 mRNA相对表达量分别为1.147±0.024、1.014±0.042和0.435±0.055,较Lipo组的1.411±0.065明显减少(t值分别为7.187、9.018和20.689,P值均＜0.01);HMGB1蛋白相对表达量分别为0.369±0.035、0.340±0.028和0.097±0.020,较Lipo组的0.553±0.051明显减少(t值分别为6.678、7.919和17.287,P值均＜0.01),其中以siRNAH3抑制效果最好,抑制率可达到80%.转染siRNAH3后HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制,与Lipo组相比,72、96、120h时F值分别为34.651、540.550、3778.197,P值均＜0.01,HepG2细胞凋亡指数明显增高(F=130.696,P＜0.01).结论 靶向HMGB1基因的siRNA分子片段可以有效地抑制HepG2细胞生长,促进HepG2细胞凋亡,其作用与下调HMGB1的表达有关,HMGB1可能是肝癌治疗的一个潜在靶点.     

Inhibition of hepatitis B virus surface antigen expression by small hairpin RNA in vitro

AIM: To explore the anti-hepatitis B virus effect of RNA interference (RNAi) using small hairpin RNA (shRNA) expression vector. METHODS: Hepatitis B virus surface antigen green fluorescent protein (HBs-GFP) fusion vector and shRNA expression vectors were constructed and cotransfected transiently into HepG2 cells. mRNAs extracted from HepG2 cells were detected by real-time PCR. Fluorescence of HBs-GFP protein was detected by fluorescence-activated cell sorting (FACS). The effective shRNA expression vector was transfected into HepG2.2.15 cells. HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells were analyzed by radioimmunoassay (RIA) method. RESULTS: FACS revealed that shRNA targeting at HBsAg reduced the GFP signal by 56% compared to the control. Real-time PCR showed that HBs-GFP mRNA extracted from HepG2 cells cotransfected with pAVU6+27 and HBs-GFP expression plasmids decreased by 90% compared to the empty vector control. The expressions of HBsAg and HBeAg were also inhibited by 43% and 64%, respectively. CONCLUSION: RNAi using shRNA expression vector can inhibit the expression of HBsAg, providing a fresh approach to screening the efficient small interfering RNAs (siRNAs).     

抑制Survivin表达对胰腺癌细胞凋亡的影响

目的 探讨以Survivin为靶基因的胰腺癌基因治疗的可能性,为胰腺癌基因治疗提供依据.方法 采用化学合成的小十扰RNA(siRNA)和pGCSi载体中的小发夹RNA(shRNA)抑制胰腺癌细胞系PaTu8988的Sunrivin基因表达,通过观察胰腺癌细胞株Survivin基因表达的下调以及细胞形态、细胞凋亡、细胞活力、凋亡信号途径等的改变评价Survivin作为靶基因的治疗效果.结果 不同序列的siRNA和shRNA抑制胰腺癌细胞Survivin的表达后,Survivin mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);碘化吡啶(PI)染色法观察发现RNA干扰(RNAi)后细胞出现核皱缩、细胞凋亡率>20%;流式细胞仪检测发现RNAi后在G0/G1期前出现了亚二倍体峰(P<0.05);Western blot法检测发现RNAi后Casptrqe-3被激活(P<0.05).结论 通过抑制胰腺癌细胞PaTu8988的Survivin表达可以诱导肿瘤细胞启动凋亡程序,加速肿瘤细胞凋亡,由此可望提高胰腺癌的治疗效果.     

沉默热休克蛋白70-2基因经线粒体依赖通路介导肝癌细胞凋亡

目的 探讨沉默热休克蛋白(HSP)70-2对肝癌细胞生长、凋亡的影响,以及诱导肝癌细胞凋亡的详细作用机制. 方法 Westem blot、免疫细胞化学法检测HSP70-2在4种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达.设计合成针对HSP70-2基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),构建真核表达载体HSP70-2 shRNA1和HSP70-2 shRNA2.转染肝癌细胞后,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,膜联蛋白/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡情况,罗丹明染色检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测多聚ADP-核糖聚合酶、caspase-3、caspase-9蛋白切割情况,以及细胞色素C、Bax,Bcl-2蛋白的表达变化. 结果 HSP70-2在4种肝癌细胞中均高表达,在L02细胞中仅有微量表达.HSP70-2 shRNA1、shRNA2均能有效抑制肝癌细胞中HSP70-2的表达.沉默HSP70-2基因显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,转染48 h后,shRNA1和shRNA2诱导HepG2细胞的凋亡指数分别为55.8%±1.8%和57.1%±1.6%,诱导Huh细胞凋亡指数分别为54.9%±1.1%和60.2%±2.6%,与对照组相比,差异均有统计学意义,P值均＜0.01.转染HSP70-2 shRNA 48 h后,肝癌细胞线粒体跨膜电位显著下降,细胞色素C从线粒体释放到胞质中,caspase-3、caspase-9激活,多聚ADP核糖聚合酶被剪切降解,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达明显增加.结论 沉默HsP70-2能通过激活线粒体凋亡通路导致肝癌细胞凋亡.     

survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对人胃癌细胞株中survivin表达的影响

背景:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,在胃癌组织中高表达。目的:构建survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并观察其对人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中survivin表达的影响。方法:根据GenBank中survivin基因序列设计并合成能转录shRNA的双链DNA序列,插入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNA-shSUR。重组载体经鉴定后转染胃癌细胞株BGC823和SGC7901,以转染pRNA-shControl作为阴性对照。荧光显微镜下观察转染情况,蛋白质印迹法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测胃癌细胞凋亡情况。结果:成功构建了针对survivin基因的shRNA表达载体。转染胃癌BGC823和SGC7901细胞48 h后,与阴性对照组相比,pRNA-shSUR组GFP表达增强,survivin蛋白表达受到明显抑制(P<0.05),胃癌细胞早期凋亡率明显增加。结论:成功构建靶向survivin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染胃癌细胞后可抑制survivin蛋白表达并促进细胞凋亡,为进一步研究survivin基因与胃癌生物学行为以及化疗耐药等的相关性奠定了基础。