远隔缺血预适应大鼠血清外泌体减轻氧糖剥夺的SH-SY5Y细胞损伤

目的:探讨远隔缺血预适应(RIPC)大鼠血清外泌体(RIPC-Exo)对氧糖剥夺(OGD)处理的人神经母细胞瘤来源的细胞系SH-SY5Y细胞的保护作用。方法:对成年SD大鼠进行RIPC处理,利用试剂盒提取血清中外泌体,用Western Blot检测外泌体特异性标志物CD9和CD63的表达。SH-SY5Y细胞分为对照组、OGD处理组、正常大鼠血清源性外泌体处理组(OGD+Normal-Exo)和RIPC大鼠血清源性外泌体处理组(OGD+RIPC-Exo)。利用CCK-8方法检测SH-SY5Y细胞活性,利用商品化试剂盒检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性和细胞内丙二醛(MDA)的含量,利用Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:RIPC-Exo处理可显著增加OGD处理SH-SY5Y细胞的活性,降低培养上清中LDH活性,以及细胞中MDA的含量。此外RIPC-Exo处理显著减少OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。结论:RIPC大鼠产生外泌体能减轻OGD诱发的SH-SY5Y细胞损伤,这可能是RIPC对远隔器官发挥保护作用的机制之一。     

13-MTD对氧反常诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的影响

目的:研究13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoic acid,13-MTD)对SH-SY5Y神经细胞氧反常的保护作用。方法:采用体外细胞培养建立SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再复氧糖(OGD/R)模型,光镜观察细胞形态,SRB法检测细胞存活率,AO/EB双重染色法观察细胞凋亡,MTT法检测线粒体活性,Rhodamine-123染色流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果:与正常对照组细胞相比,OGD/R模型组SH-SY5Y细胞出现明显病理损伤,细胞凋亡率显著增加(P0.01),线粒体活性、细胞存活率、线粒体膜电位均显著下降(P0.01);不同剂量的13-MTD可显著改善以上变化(P0.01),且存在剂量依赖关系。结论:13-MTD对OGD/R诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤有保护作用,其可能对脑缺血再灌注损伤具有治疗作用。     

利多卡因对SH-SY5Y细胞的损伤作用

目的: 采用SH-SY5Y细胞体外培养模型,通过观察细胞形态、测定细胞活力和细胞凋亡率,探讨不同浓度利多卡因对SH-SY5Y细胞的损伤作用。方法: SH-SY5Y细胞离体培养, 分为4组, 即: 正常培养组(对照组, 未经药物处理); 0.5%、1%、2%利多卡因组(L1、L2、L3组), 分别用相应浓度的利多卡因处理SH-SY5Y细胞10 min。在药物处理10 min后观察细胞形态, 并分别在药物处理后5 min (T1)、10 min (T2)、药物处理结束后15 min (T3)、药物处理结束后12 h (T4)测定细胞活力及细胞凋亡率。结果: 正常培养SH-SY5Y细胞胞体粗大, 呈多角形, 出现树突状突起, 神经突起, 多而粗大, 分布成网络, 各实验组SH-SY5Y细胞则变圆, 回缩, 轴突渐消失。各实验组不同浓度的利多卡因对SH-SY5Y细胞活力均有明显影响, 利多卡因处理5 min后, 各组细胞活力明显下降, 且随剂量增加, 细胞活力下降明显增加。对照组细胞凋亡率在各时点保持在5.9%~6.3%之间, 实验组细胞在利多卡因处理后各时点细胞凋亡率明显增加, 且随着浓度的增加,细胞凋亡率也增加。结论: 0.5%、1%、2%利多卡因对SH-SY5Y细胞均有损伤作用, 且随浓度的增加,损伤程度加重。     

三七总皂苷抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的SH-SY5Y细胞焦亡

目的:探讨三七总皂苷(PNS)对缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)诱导的SH-SY5Y细胞焦亡的调控作用。方法:以OGD/R诱导构建体外缺血再灌注SH-SY5Y细胞模型,观察PNS对SH-SY5Y细胞活力(CCK-8法)及细胞膜通透性[表示为乳酸脱氢酶(LDH)漏出率和碘化丙啶(PI)染色阳性细胞比例]的影响,分析PNS对细胞中gasdermin D(GSDMD)、GSDMD N端片段(GSDMD-N)、caspase-1和caspase-4蛋白水平变化以及白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18释放的影响。结果:OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞活力显著降低(P<0. 01),LDH漏出率和PI染色阳性细胞比例显著升高(P<0. 01),即细胞通透性增加;细胞内GSDMD、GSDMD-N、caspase-1及caspase-4蛋白水平显著升高,IL-1β和IL-18释放显著增加(P<0. 01)。PNS干预可增强OGD/R抑制的SH-SY5Y细胞活力(P<0. 01),降低LDH漏出率和PI染色阳性细胞比例(P<0. 05或P<0. 01),即降低细...     

自噬参与低氧预处理抗PC12细胞糖氧剥夺损伤过程

目的:观察低氧预处理(HPC)对氧糖剥夺(OGD)损伤的PC12细胞的作用,同时探讨自噬在其中的作用。方法:培养的PC12细胞按照处理因素分为6组:对照组、HPC模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、低氧预处理后氧糖剥夺(HPC+OGD)组、3-甲基腺嘌呤预处理后行低氧预处理及氧糖剥夺(3-MA+HPC+OGD)组和OGD组。CCK-8检测细胞存活率;caspase-3活性检测试剂盒检测酶活性;TUNEL染色和流式细胞术检测细胞凋亡的情况;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、beclin-1和凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果:与对照组相比,OGD组细胞存活率明显降低;与3-MA+HPC+OGD组及OGD组相比,HPC+OGD组细胞存活率明显升高(P0.05)。与对照组相比,OGD组细胞的caspase-3酶活性明显升高;与3-MA+HPC+OGD组及OGD组相比,HPC+OGD组的caspase-3酶活性明显降低(P0.05)。与对照组相比OGD组细胞凋亡明显增多;HPC+OGD组与OGD组相比凋亡明显减少(P0.05)。此外,与对照组相比,OGD组的激活型caspase-3蛋白水平明显升高(P0.05);且HPC+OGD组与OGD组相比激活型caspase-3蛋白水平明显减少而LC3、beclin-1的蛋白水平明显升高(P0.05)。结论:HPC抗OGD损伤的机制可能与其激活细胞自噬有关。     

DADLE对SH-SY5Y细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的：探讨[D-Ala2,D-Leu5] enkephalin（ DADLE）对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞的缺氧复氧的保 护作用。方法：将体外培养的SH-SY5Y 细胞分别缺氧6 、12、24 h 和48 h,均复氧4 h 后观察细胞形态改变,采用 MTT法检测细胞生存率,评估细胞损伤程度。在此基础上,于缺氧12 h 期间首先给予DADLE 100 pmol/L 作用于 细胞,评价DADLE能否减轻神经细胞缺氧复氧损伤;继而分别用10 pmol/L、100 pmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L 和100 nmol/L 不同浓度的DADLE溶液处理细胞,研究DADLE保护作用是否具有剂量效应关系。结果：SH-SY5Y 细胞缺氧6、12、24 h 或48 h,复氧4 h 后,细胞生存率分别为（68.1±4.3）％、（52.6±2.8）％、（26.7±1.5）％ 或（3.5±1.7）％。SH-SY5Y 细胞缺氧12 h 期间给予DADLE 100 pmol/L 处理可使细胞生存率上升到（58.7±0.46）%。 5 个给药浓度中,10 pmol/L 和100 pmol/L DADLE可使神经细胞生存率上升,而1、10 nmol/L 和100 nmol/L 则变 化不明显。结论：DADLE对SH-SY5Y 的缺氧复氧损伤具有保护作用,且其保护效果呈现出较小剂量优于较大剂量 的量效关系,本实验中最佳保护剂量为10 pmol/L。     

胞外高浓度ATP诱导SH-SY5Y细胞的自噬和凋亡

 目的：观察胞外高浓度ATP损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,探讨损伤中自噬和凋亡发生的规律和特点。方法：培养的SH-SY5Y细胞按照加入ATP的浓度和作用时间进行分组。CCK-8法检测细胞生存率,单丹磺酰戊二胺染色检测自噬空泡的变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率变化,蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ）的表达。结果：（1）与对照组相比,不同浓度（3、6、9、12、15 mmol/L）的ATP作用3 h均使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,且呈剂量依赖性;不同作用时间（1、2、3、6 h）ATP（6 mmol/L）也可使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,3 h达高峰,呈时间依赖性。（2）ATP作用1 h时SH-SY5Y细胞自噬空泡显著增多（P<005）,随时间延长,6 h时降到对照水平;ATP作用1 h时,LC3-Ⅱ表达显著增强（P<005）,形成高峰,与自噬空泡增多的时点重合,2 h、3 h时LC3-Ⅱ表达水平逐渐减弱,6 h时降到对照水平。（3）与对照组相比,ATP作用3 h后细胞凋亡率达高峰（P<005）,6 h时仍然保持在3 h的水平;cleaved caspase-3表达量同步增强（P<005）,6 h时达高峰。结论：胞外高浓度ATP能够诱导SH-SY5Y细胞自噬和凋亡;自噬增强在前,凋亡高潮在后;随着ATP作用时间的延长,凋亡占主导地位。     

孕酮减轻ATP诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的:探讨孕酮对抗腺苷三磷酸(ATP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用和机制。方法:取对数生长期的SH-SY5Y细胞按照孕酮或ATP浓度的不同进行分组,CCK-8法检测细胞存活率,YO-PRO-1染色检测细胞膜通透性,Fluo-3染色检测细胞内Ca~(2+)浓度的变化,Western blot法检测嘌呤能P2X_7受体表达的变化。结果:与对照组相比,不同浓度(1、3、5和7 mmol/L)ATP作用2 h,SH-SY5Y细胞存活率显著降低(P0.05),细胞摄入YO-PRO-1的荧光强度明显增加(P0.05),且呈剂量依赖性。浓度为3、10和30 nmol/L的孕酮预孵育30 min可减轻ATP损伤作用,细胞存活率较单纯ATP组明显升高(P0.05或P0.01)。孕酮(30nmol/L)或P2X_7受体拮抗剂KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min均可显著抑制ATP诱导的胞内YO-PRO-1的荧光增强(P0.01),而孕酮和KN-62两者之间没有明显差异。正常组细胞内钙离子含量少,ATP组细胞内钙离子荧光强度较对照组明显增高(P0.05),孕酮(30 nmol/L)或KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min可明显降低(P0.05)ATP诱导的胞内钙荧光增强,而孕酮和KN-62两者之间的作用无明显差异。ATP组SH-SY5Y细胞P2X_7受体表达较对照组明显增加(P0.05),而孕酮(30 nmol/L)预孵育30 min则可显著降低ATP诱导的P2X_7受体表达(P0.05)。结论:孕酮可抑制ATP诱导的P2X_7受体表达、膜孔形成和胞内Ca~(2+)升高,降低细胞死亡率,明显减轻高浓度ATP对SH-SY5Y细胞的损伤作用。     

葡萄籽原花青素提取物对HT22细胞糖氧剥夺损伤的保护作用

目的:通过研究小鼠海马神经元细胞系HT22细胞糖氧剥夺(OGD)后凋亡/自噬相关蛋白表达的变化,探讨葡萄籽原花青素提取物(GSPE)预处理对OGD诱导的HT22细胞损伤的保护作用。方法:将HT22细胞分为对照组、OGD组、OGD+GSPE组。CCK8法检测OGD不同时间(4、6、8 h)干预后HT22细胞的活性,确定后续实验中OGD时间; CCK8法检测同一OGD时间下,不同GSPE浓度(20、40、100、200μmol/L)处理后HT22细胞的活性,确定GSPE最佳浓度;免疫荧光技术标记Tubulin蛋白,观察细胞形态的改变; AnnexinⅤ-FITC/PI染色和TUNEL染色检测细胞凋亡;免疫荧光技术检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ和Beclin1等蛋白的表达量变化; caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3相对活性。结果:观察细胞形态结果表明:对照组细胞形态完整、胞体较大,OGD组中细胞大量皱缩成团、胞体变小,OGD+GSPE组细胞状态较OGD组明显改善;观察细胞凋亡情况结果表明:和OGD组相比,GSPE预处理后的HT22细胞...     

缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞自噬的形态学变化与细胞凋亡的关系

目的:观察缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞自噬的形态学变化及其与细胞凋亡的关系,探讨自噬对PC12细胞的保护作用。方法:取对数生长期的PC12细胞,随机分为正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组。其中缺氧缺糖/复氧复糖组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组进行缺氧缺糖3 h后再复氧复糖12 h,自噬抑制剂组和自噬激活剂组于复氧复糖的同时分别给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和自噬激活剂雷帕霉素。用透射电子显微镜和单丹磺酰尸胺荧光染色检测自噬小体的变化,Annexin V-FITC/PI流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡的情况。结果:与正常对照组相比,缺氧缺糖/复氧复糖组的自噬小体增多(P0.05),细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05)。与缺氧缺糖/复氧复糖组相比,自噬抑制剂组的自噬小体明显减少(P0.05),细胞凋亡率和凋亡指数显著升高(P0.05),而自噬激活剂组自噬小体变大,数量明显增多(P0.05),并偶见自噬溶酶体,细胞凋亡率和凋亡指数显著下降(P0.05)。结论:缺氧缺糖/复氧复糖可以诱导PC12细胞发生自噬,且细胞自噬可以抑制细胞凋亡,发挥神经保护作用。     

氧糖剥夺/复氧所致细胞焦亡在肺微血管内皮细胞损伤中的作用

目的:探讨氧糖剥夺/复氧(OGD/R)是否导致人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)焦亡及其在细胞损伤中的作用.方法:采用HPMVECs复制OGD/R细胞模型,模拟体外循环中HPMVECs缺血/再灌注过程.将细胞分为对照(control)组(正常培养)、OGD/R组(OGD 8 h+恢复12 h)及VX-765(casp...     

瑞舒伐他汀改善缺氧/复氧引起的脑微血管内皮细胞损伤的作用

目的:探讨瑞舒伐他汀改善缺氧/复氧引起的小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)损伤的作用及其可能机制。方法:原代分离培养BALB/c小鼠BMECs,利用氧糖剥夺/复氧模拟体外缺血再灌注损伤,以瑞舒伐他汀处理干预。观察细胞形态,通过MTT实验测定BMECs细胞的活力,荧光染料羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA-SE)细胞增殖检测试剂盒观察造模及用药后细胞数目百分比的变化;免疫荧光染色检测细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的水平; Western blot法检测Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP) 2、MMP9、磷酸化核因子κB(phosphorylated nuclear factor kappa B,p-NF-κB)、磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated P38 mitogen-activated protein kinase,p-P38)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)的蛋白水平。结果:浓度为10μmol/L的瑞舒伐他汀可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的BMECs存活率减低现象,同时维持BMECs结构。此外,瑞舒伐他汀能够显著抑制cleaved caspase-3、MMP2、MMP9、p-NF-κB、p-P38及p-JNK的蛋白水平(P 0. 05),上调氧糖剥夺/复氧导致的Bcl-2/Bax降低(P 0. 05)。结论:瑞舒伐他汀可通过降低凋亡相关蛋白及基质金属蛋白酶的表达,对抗缺氧/复氧引起的BMECs损伤,提示其在缺血再灌注损伤时维持血脑屏障完整性方面具有潜在应用价值。     

Calpastatin reduces calpain and caspase activation in methamphetamine-induced toxicity in human neuroblastoma SH-SY5Y cultured cells

Methamphetamine (METH) is an abused psychostimulant drug that can cause neurotoxicity to dopaminergic cells. It has been demonstrated that METH can induce caspase- and calpain-dependent death cascades. The purpose of the present study was to investigate the functional role of calpastatin, a specific endogenous calpain inhibitor protein, on caspase and calpain activation in METH-induced degeneration in neuroblastoma SH-SY5Y cell cultures. In this study, we found that METH significantly decreased cell viability, tyrosine hydroxylase phosphorylation and calpastatin levels. Supplementation of cells with exogenous calpastatin was able to reverse the toxic effect of METH on reduction in cell viability and tyrosine hydroxylase phosphorylation. METH also significantly increased calpain levels, the formation of calpain-specific breakdown products and cleaved caspase-3 levels; once again, these effects were diminished by pretreating the cells with calpastatin. These data suggest the contribution of calpastatin as a potential regulatory factor for calpain- and caspase-dependent death processes.     

肿瘤抑制剂GA对SH-SY5Y细胞凋亡的影响及分子机制研究

为了探讨HSP90特异的功能抑制剂geldanamycin(GA)能否用于神经母细胞瘤的临床治疗 ,通过检测未分化的和全反式维甲酸 (RA)诱导分化的神经母细胞瘤SH SY5Y细胞在不同浓度GA处理后的细胞存活率 ,发现GA呈剂量依赖性诱导SH SY5Y细胞凋亡 ,但是分化细胞对同样剂量的GA不是很敏感 [细胞存活率依次为 (82 0±6 0 ) %比较 (6 5 0± 3 0 ) % ,P <0 0 2 ;(6 7 9± 3 1) %比较 (4 3 4± 3 9) % ,P <0 0 3;(4 3± 0 8) %比较 (0 4±0 1) % ,P <0 0 5 ]。Western印迹分析和免疫荧光实验显示 ,GA能抑制细胞中c Jun和c Fos的表达 ,并且GA剂量越高 ,其抑制越明显 ;同时GA也诱导了p5 3的核聚集。与未分化细胞相比 ,在相同剂量GA处理后分化细胞中c Jun和c Fos的表达均比未分化细胞略高 ;但是分化细胞中p5 3的核聚集却不如前者明显。提示未分化细胞对同样剂量的GA比分化细胞更敏感 ,可能与分化细胞能抵抗GA引起的c Jun、c Fos的降低以及p5 3的核聚集有关。     

Glutathione S-transferase pi regulates UV-induced JNK signaling in SH-SY5Y neuroblastoma cells

Activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway is a key event in apoptosis. The cellular mechanisms underlying the control of JNK catalytic activity before and immediately after stress in neuronal cells are still not completely understood. Under resting conditions the basal activity of JNK is low, since JNK is kept inactive by the presence of one or more endogenous repressors, including glutathione S-transferase pi (GSTpi). The aim of this study was to investigate the control of JNK signaling by GSTpi. We examined the modifications of GSTpi protein expression and oligomerization after UV irradiation-induced stress in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. In parallel, we investigated the effect of UV irradiation on JNK activation and c-Jun phosphorylation, and whether apoptosis represents a functional consequence triggered by this signaling pathway. We show that in SH-SY5Y cells JNK phosphorylation and activation precedes c-Jun phosphorylation and caspase-3 cleavage. Importantly, the increase of JNK enzymatic activity correlates with the dissociation of GSTpi–JNK complexes and the increased concentration of GSTpi multimer forms. Results presented herein show for the first time direct interaction between JNK and GSTpi in SH-SY5Y neuroblastoma cells, and suggest that in these cells GSTpi may serve as a regulator of JNK catalytic activity. This work contributes to further elucidate the mechanisms underlying the regulation of JNK activity under stress conditions.