TRPC1在TGF-β1诱导支气管上皮细胞间充质转化中的作用

目的:探究经典瞬时受体电位通道1(TRPC1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)间充质转化(EMT)中的作用。方法:以16HBE细胞株为研究对象,免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测16HBE细胞EMT过程中TRPC1 mRNA和蛋白的表达;Western blotting检测TRPC1阻断剂和siRNA干扰对16HBE细胞EMT的影响。结果:(1)TGF-β1刺激后细胞形态明显改变,E-钙黏蛋白表达减少(P0.01),而α-SMA蛋白表达增加(P0.05)。(2)TRPC1广泛存在于16HBE细胞,且TGF-β1刺激后TRPC1 mRNA和蛋白的表达增加(P0.05)。(3)与TGF-β1组相比,阻断剂和TGF-β1共同作用组或siRNA和TGF-β1共同作用组细胞形态改变受抑制,E-钙黏蛋白和α-SMA蛋白表达受抑制(P0.05)。结论:TGF-β1诱导16HBE细胞发生EMT,其机制可能与其上调16HBE细胞TRPC1有关。     

TRPC1在TGF-β1诱导支气管上皮细胞迁移中的作用

 目的: 探究经典瞬时受体电位通道1(TRPC1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)迁移中的作用。方法: siRNA沉默TRPC1; CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡; 细胞划痕和Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭。Western blot检测E-钙黏蛋白和vimentin的蛋白表达。结果: TGF-β1刺激细胞后,TGF-β1组细胞的迁移距离大于对照组(P < 0.01)。TGF-β1组和TRPC1沉默组的细胞活力和凋亡与对照组相比差异不显著;与TGF-β1组细胞比较,siRNA和 TGF-β1 共同作用组迁移能力明显降低(P < 0.01)。与 TGF-β1 组相比,siRNA沉默TRPC1和 TGF-β1 共同作用组E-钙黏蛋白的蛋白表达明显降低(P < 0.05),而vimentin的蛋白表达明显增强(P < 0.05)。结论: TRPC1通过调节E-钙黏蛋白和vimentin 的蛋白表达参与了TGF-β1诱导人支气管上皮细胞迁移的过程。     

Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β_1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用

目的:通过观察转化生长因子β_1(TGF-β_1)诱导前后Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关分子的表达情况,探讨A549/DDP细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制。方法:TGF-β_1(5μg/L)作用48 h,观察A549/DDP细胞的形态变化,并测定EMT标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)的表达情况,评估TGF-β_1是否成功诱导A549/DDP细胞发生EMT。进一步将A549/DDP细胞分为TGF-β_1(+)组、TGF-β_1(-)组和LY294002组,应用Western blot法检测各组Akt/GSK-3β/Snail通路相关分子Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平。结果:形态学观察可见TGF-β_1(+)组的细胞变得更加狭长,呈纺锤形,细胞间较为疏散,形态与间充质细胞相似。与TGF-β_1(-)组比较,TGF-β_1(+)组E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin蛋白表达上调(P0.05);各组间Akt和GSK-3β的蛋白表达水平并无明显差别,TGF-β_1(+)组的p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平较TGF-β_1(-)组明显增强(P0.05);PI3K抑制剂LY294002与TGF-β_1同时刺激细胞后,p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平较TGF-β_1(+)组下调(P0.05)。结论:TGF-β_1干预Akt/GSK-3β/Snail信号通路,促进Akt和GSK-3β的磷酸化,提高Snail的表达水平,诱导A549/DDP细胞发生EMT。     

蟾蜍灵抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞-间充质细胞系转换

目的探讨蟾蜍灵对转化生长因子(TGF)-β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质细胞转换的影响。方法将体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞分为3组:1)对照组;2)TGF-β1组:在细胞培养基中加入TGF-β1(浓度为5μg/L);3)蟾蜍灵+TGF-β1组:在细胞培养基中分别加入蟾蜍灵和TGF-β1(浓度为5μg/L),按蟾蜍灵的浓度分为A、B、C 3个亚组:分别为1×10~(-9)、1×10~(-8)和1×10~(-7)mol/L。72 h后,用倒置相差显微镜观察细胞形态;用实时定量PCR、蛋白印迹法和免疫荧光检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。结果 TGF-β1组HK-2细胞从原有典型的铺路石样上皮细胞转变为长梭形肌成纤维细胞;胞质内大量表达α-SMA,同时E-cadherin的表达明显减少(P0.01);蟾蜍灵处理后TGF-β1诱导的细胞形态学改变减轻,胞质内α-SMA的表达减少(P0.05),同时E-cadherin的表达明显恢复,且呈剂量依赖性。结论蟾蜍灵能有效抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞转换,对肾脏病治疗具有潜在应用前景。     

马兜铃酸诱导大鼠肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积及垂盆草提取物的作用

 目的：研究垂盆草（SSB）提取物对马兜铃酸（AA）诱导的肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积的作用,并初步探讨可能的分子机制。方法：将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）分为：(1) 溶剂对照组：未加入SSB和AA;(2) AA损伤组：只加AA,浓度为1~100 mg/L;(3) SSB提取物干预组：在加入10 mg/L AA基础上,同时加入SSB提取物（10~2 000 mg/L）。细胞培养24 h后,酶联免疫吸附试验检测转化生长因子β1(TGF-β1)含量;细胞免疫荧光染色检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、上皮细胞标志物E-cadherin和基质成分III型胶原的表达;实时荧光定量PCR检测α-SMA、E-cadherin、骨形成蛋白7（BMP-7）和I型胶原mRNA的表达。结果：AA可诱导NRK-52E细胞呈现纤维化样改变;1 mg/L和10 mg/L AA不仅可增加基质成分I型和III型胶原的表达量,同时也可促进α-SMA表达,抑制E-cadherin的表达。用SSB提取物干预后,AA所致的纤维化改变明显减轻;SSB提取物下调了α-SMA、I型和III型胶原的表达,并且促进E-cadherin和BMP-7的表达。此外,SSB提取物也抑制TGF-β1的分泌,并呈浓度依赖性。结论：应用SSB提取物干预可明显降低AA所致的肾纤维化效应,可能的机制为SSB提取物降低TGF-β1的表达,抑制小管上皮细胞的表型转化,进而抑制胶原的累积。     

人脐带血干细胞抑制大鼠肺纤维化及肺巨噬细胞TGF-β1的表达

目的 研究人脐血间充质干细胞对博来霉素所致的大鼠肺纤维化及TGF-β1的影响.方法 取清洁级健康雄性SD大鼠60只随机分为博来霉素组(P组)、干细胞治疗组(M组)、地塞米松治疗组(D组)和阴性对照组(N组),取第2代人脐血间充质干细胞培养至第4代;P组、M组和D组分别经气管注入博来霉素制造肺纤维化模型,M组造模后立即经鼠尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的干细胞,D组造模后第2天开始连续7d腹腔注射地塞米松,N组经气管注入等量生理盐水,在第7、14、28天处死各组大鼠,行HE、Masson染色,免疫组织化学法观察TGF-β1表达及标记细胞情况.结果 M组第7、14、28天肺组织均可见标记的干细胞;HE及Masson染色后观察,与N组相比,P组7d时肺泡炎最明显,28 d肺纤维化程度最重,M、D组较P组轻且病理切片可见M组较D组肺泡炎及纤维化程度稍轻;肺组织中TGF-β1在P组7d时最高,M、D组明显少于P组,M组减少更明显,组间差异有统计学意义.结论 人脐血间充质干细胞可以定植于肺组织中,在肺纤维化早期通过抑制TGF-β1的表达,可能减轻肺泡炎及肺纤维化.     

吡非尼酮抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞表型转化

目的:研究吡非尼酮(PFD)是否抑制转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肺成纤维细胞(HLFs)表型转化。方法:MTT法检测细胞存活率;Ed U法检测细胞的增殖能力;Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,Western blot法和细胞免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白水平,实时荧光定量PCR检测α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平。结果:不同浓度的吡非尼酮(0.1、0.2、0.3、0.5和0.8 mg/L)无明显的细胞毒性作用,后续实验应用0.2 mg/L为干预浓度。吡非尼酮(0.2 mg/L)预处理HLFs能明显地抑制TGF-β1诱导的细胞增殖、迁移和侵袭能力,下调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平(P0.05),并且干扰TGF-β1诱导的细胞骨架重组和表型转化,使α-SMA的mRNA和蛋白水平均下降(P0.05)。结论:吡非尼酮能有效地抑制TGF-β1所诱导的HLFs细胞功能和表型转化。     

虫草素抑制哮喘大鼠支气管上皮细胞间充质转化

目的 考察虫草素(Cor)抑制哮喘大鼠上皮细胞间充质转化的作用机制.方法 将大鼠随机分为4组(n=10):对照组、模型(OVA)组、OVA+10 mg/kg Cor组、OVA+50 mg/kg Cor组.治疗7 d后,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数,苏木精-伊红(HE)染色评价气道炎性反应和气道重塑程度,...     

TGF-β诱导上皮间充质转化的信号通路研究

上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞脱黏附而转变成具有迁移能力的间质细胞的现象,它在胚胎发育、肿瘤转移及组织纤维化过程中都发挥重要的生理和病理作用.转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)作为EMT发生过程...     

氧化苦参碱抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化及其机制研究

 目的：探讨氧化苦参碱(OM)对高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化（EMT）的抑制作用及其可能机制。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮NRK52E细胞,随机分为：对照组、高糖组、高糖+OM不同浓度组和高糖+0.50 g/L OM动态观察组。采用real-time PCR和Western blotting方法检测转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏素（E-cadherin）mRNA和蛋白的表达。结果：（1）与对照组相比,高糖组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达水平均进行性增高,Smad7蛋白表达进行性降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达进行性降低,呈时间依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达进行性增高（P＜0.05）;（2）与高糖组相比,高糖+ OM不同浓度组随OM剂量增加,TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达均逐渐降低,Smad7蛋白表达水平逐渐增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,且呈剂量依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异;（3）与高糖组相比,高糖+0.50 g/L OM动态观察组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达持续降低,Smad7蛋白表达持续增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达持续增高（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异。结论：OM可抑制高糖诱导的NRK52E细胞发生EMT,其机制可能与OM下调TGF-β1表达及上调Smad7蛋白表达,进而抑制TGF-β1/Smads信号通路的致纤维化效应有关。     

PI3K/CTGF信号通路在TGF-β1诱导A549细胞表达collagen I过程中的作用

 目的： 研究磷脂酰肌醇3-激酶/结缔组织生长因子（PI3K/CTGF）信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人肺腺癌A549细胞表达I型胶原蛋白（collagen I）过程中的分子机制。方法： 体外培养A549细胞,予TGF-β1刺激,观察CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达及PI3K信号通路的活化;PI3K抑制剂LY294002预先处理A549细胞后,观察TGF-β1刺激下CTGF和collagen I mRNA和蛋白表达的变化;CTGF特异性siRNA干扰A549细胞中CTGF的表达后,观察TGF-β1刺激下collagen I mRNA和蛋白表达的变化和PI3K信号通路的活化。结果： TGF-β1可以诱导A549细胞中CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表达以及PI3K信号通路的活化;PI3K特异性抑制剂LY294002可以部分逆转TGF-β1诱导的A549细胞中CTGF和Collagen I mRNA和蛋白表达的升高。干扰CTGF可以降低TGF-β1诱导的A549细胞collagen I mRNA和蛋白表达,而不影响PI3K信号通路的活化。结论： CTGF是TGF-β1/PI3K信号通路调控的即刻早期反应效应蛋白,参与了TGF-β1诱导的A549细胞中collagen I表达。     

慢性酒精摄入所致的肝细胞上皮-间充质转化参与小鼠肝纤维化形成

 目的：探讨慢性酒精摄入对肝组织病理学改变的影响及上皮-间充质转化对肝纤维化形成的作用。方法：将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为3组：对照组灌胃给予与酒精组等体积的蒸馏水,低剂量和高剂量酒精组分别灌胃给予2.0 g·kg -1·d -1和 4.0 g·kg -1·d -1酒精5个月。肝组织病理学改变和纤维化分别用HE和 Masson三染色观察;荧光标记的TUNEL法检测肝组织细胞凋亡;自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性;肝组织成纤维细胞特异性蛋白1（FSP-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏素表达采用免疫荧光观察;E-钙黏素、α-SMA、FSP-1、转化生长因子β 1 (TGF-β 1) 和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白表达水平用Western blotting 检测。结果：与对照组相比,小鼠酒精灌胃5个月后,血清ALT和AST活性升高;肝组织细胞凋亡增加;低剂量酒精组呈现肝脂肪变性和轻度的肝纤维化,高剂量酒精组呈现出严重的肝纤维化;肝组织丙二醛（MDA）含量升高,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）下降;肝细胞E-钙黏素表达下降,α-SMA表达增加;低剂量酒精组肝细胞内白蛋白和FSP-1共定位,而高剂量酒精组肝细胞内只表达FSP-1;Western blotting检测结果显示,E-钙黏素表达下降,而α-SMA、FSP-1、TGF-β 1和HIF-1α蛋白表达水平升高,但是HIF-1α蛋白表达水平在高、低酒精组之间无差别。结论：慢性酒精摄入可诱导肝纤维化,部分成纤维细胞来源于肝细胞上皮-间充质转化,其机制可能与肝细胞氧化状态、TGF-β 1及HIF-1α升高有关。     

葛根素注射液对糖尿病KKAy小鼠肾小管上皮细胞的影响

 目的：观察葛根素治疗糖尿病小鼠肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）过程中肾小管上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白表达的变化,为临床药物治疗糖尿病RIF提供实验依据。方法：将16只2型糖尿病模型KKAy小鼠随机分为模型组（n=8）和葛根素注射液治疗组（n=8）。8只C57BL/6J小鼠作为正常组。用药组小鼠14周龄开始以腹腔注射的方式给药,观测小鼠日常状态及血糖变化,于24周龄处死小鼠,取肾脏分别观察肾组织病理形态学变化,免疫组织化学法检测小鼠肾组织中α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)、转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）和转化生长因子β I型受体（TGF-β-RI）蛋白的表达。结果：形态学观察可见模型组发生明显的纤维化改变,而经葛根素注射液治疗后,小鼠肾间质基质轻度增多,病变较轻微。治疗组KKAy小鼠肾组织中较模型组小鼠肾组织中α-SMA、TGF-β1和TGF-β-RI蛋白的表达减少。结论：葛根素注射液可在一定程度上减少α-SMA的表达,抑制KKAy小鼠肾脏组织中TGF-β1和TGF-β-RI蛋白表达,阻断并逆转EMT的过程,延缓肾间质纤维化的发生和发展。     

刺五加苷B/E对高糖环境下HBZY-1细胞增殖及TGF-β1和PPARγ表达的影响

目的:探讨刺五加苷B/E(ETS-B/E)对高糖环境大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1增殖的影响及机制。方法:进行HBZY-1细胞传代、无菌培养,选生长良好的第4代HBZY-1细胞,测定高糖(25 mmol/L)环境下符合生长规律曲线图的细胞密度。然后接种6组,分成低糖组(LG)、高糖组(HG)、高糖ETS-B/E(低剂量、中剂量、高剂量)组和高糖洛沙坦组(LTG)。予以相应药物干预后,测定在24 h、48 h和72 h时,其对HBZY-1细胞生长的抑制作用和抑制率,并用免疫细胞化学和Western blotting检测各组增殖过程中TGF-β1和PPARγ的表达情况。结果:HBZY-1细胞的接种浓度为每孔2 000个时,符合细胞生长基本规律,高糖显著促进HBZY-1细胞的增殖。ETSB/E作用下,在各时点,对HBZY-1细胞的抑制作用和抑制率与HG有显著差异(P0.05);免疫细胞化学和Western blotting分析均显示,ETS-B/E能显著抑制TGF-β1表达和促进PPARγ表达(P0.05),且ETS-E显著强于ETSB(P0.05),呈浓度和时间依赖性趋势。结论:ETS-B/E对高糖环境下HBZY-1细胞的增殖具有显著抑制作用,其作用机制与阻止TGF-β1的表达和促进PPARγ的表达相关。     

SphK1和FAK对人结肠癌HCT116细胞上皮间质转化的影响

 目的: 研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase l,SphK1)和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)对人结肠癌HCT116细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法: 将人结肠癌HCT116细胞分成3组:采用SphK1抑制剂N,N-二甲基鞘胺醇(N,N-dimethylsphingosine,DMS)、FAK抑制剂PF573228和相同体积的培养基分别处理细胞。MTT法检测细胞活力,Western blot方法检测SphK1、FAK、E-cadherin、N-cadherin、vimentin和基质金属蛋白酶2(MMP2)蛋白的表达,real-time PCR检测SphK1、鞘氨醇1-磷酸(S1P)、FAK、E-cadherin和vimentin mRNA的表达,并应用细胞划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力。结果: PF573228和DMS均明显抑制人结肠癌HCT116细胞的活力,并呈时间剂量依赖性。DMS抑制SphK1的表达,同时下调FAK、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白的表达,而上调E-cadherin蛋白表达上调。PF573228明显抑制FAK的表达,同时抑制SphK1、N-cadherin、vimentin和MMP2的表达,上调E-cadherin蛋白的表达(P<0.01)。划痕实验显示PF573228和DMS显著抑制HCT116细胞的迁移能力(P<0.01)。与对照组比较,PF573228组和DMS组FAK、SphK1、S1P以及vimentin mRNA的表达明显下调,而E-cadherin mRNA的表达则明显上调(P<0.05)。结论: SphK1和FAK信号通路可能在结肠癌HTC116细胞上皮间质转化过程中发挥重要作用。