HMGB1对HTLV-1病毒Tax蛋白表达的T细胞中NF-κB活性的影响

目的:构建人高迁移率组蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)的真核表达载体,转入TaxP及TaxN细胞进行表达,并研究其对Tax蛋白表达的T细胞中NF-κB活性的影响。方法:用RT-PCR方法扩增人T淋巴细胞系Jurkat细胞中HMGB1的cDNA,连接于真核表达载体pcDNA3.0;将pcDNA3.0-HMGB1转染TaxP及TaxN细胞,48小时后检测RT-PCR检测HMGB1和Tax mRNA的表达,HMGB1及p65蛋白的表达;将pcDNA3.0-HMGB1和NF-κB报告基因共转染TaxP及TaxN细胞48小时后检测荧光素酶活性。结果:成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-HMGB1;Tax可以促进HMGB1mRNA和蛋白的表达,HMGB1可以促进p65mRNA和蛋白的表达,并能上调NF-κB活性。结论:HMGB1能协同Tax蛋白激活NF-kB。     

结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的构建结核杆菌热休克蛋白-65(HSP65)真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达. 方法用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549 细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT-PCR的方法检抗性细胞中HSP65 mRNA的表达 . 结果经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确;RT-PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65 mRNA为阳性. 结论真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 , 并可在真核细胞A549细胞中稳定表达.     

NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用多肽的筛选及功能鉴定

目的以NF-κB p65亚基DNA结合域为诱饵蛋白,筛选能够与其发生相互作用的多肽,并鉴定这些多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。方法首先利用PCR搭桥扩增方法获取NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,后将其克隆到酵母双杂交pGBKT7DNA-BD载体上,与GAL4DNA-BD融合,形成GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白;再以GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白为诱饵蛋白行酵母双杂交实验,自16肽随机肽库中筛选与NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用的多肽;最后选择性人工合成筛选获得的多肽,并进行EMSA实验检测相互作用多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。结果扩增获得了NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,并成功构建pGBKT7DNA-BD/p65BD载体。自1.28×107个酵母转化子中最终筛选获得5个阳性克隆,测序结果和同源氨基酸序列比对表明5个阳性多肽为p65BD新型相互作用多肽,其中4条多肽拥有一个共同的基序。EMSA实验结果表明合成的两条多肽对NF-κB的DNA结合活性均具有一定的抑制效应。结论经初筛、复选和假阳性鉴定,自16肽库中获得5个能与NF-κB p65亚基发生相互作用的新型多肽,并已证实其中两条多肽对NF-κB的DNA结合活性具有抑制效应。     

MIAT过表达载体的构建及其对血肿瘤屏障通透性的影响

目的构建长链非编码RNA心肌梗死相关转录物(MIAT)过表达载体pcDNA3.1-MIAT,并研究其对血肿瘤屏障通透性影响。方法从与脑胶质细胞U87共培养的人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3(GECs)提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应技术扩增出MIAT基因片段,通过无缝连接技术克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染重组质粒pcDNA3.1-MIAT到GECs中,real-time PCR检测转染效率,应用跨内皮电阻测量系统和辣根过氧化物酶渗漏实验分析血肿瘤屏障通透性的变化。结果成功扩增出MIAT基因,成功构建pcDNA3.1-MIAT表达载体,Blast序列分析与GenBank中NR00349一致。转染pcDNA3.1-MIAT后,96h转染效率最高,过表达MIAT组跨内皮阻抗值最低,辣根过氧化物酶流量最高,血肿瘤屏障通透性最高。结论成功构建pcDNA3.1-MIAT表达载体,过表达MIAT使血肿瘤屏障通透性升高。     

螺杆菌感染与NF-κB p65蛋白表达相关性在人食管癌发生中的意义

目的研究人食管癌是否存在螺杆菌感染及其与NF-κB p65蛋白的关系,从而探讨在人食管癌发生中的意义。方法随机收集食管癌标本40例和正常食管标本10例,采用聚合酶链反应(PCR)扩增螺杆菌16S rRNA,随机选4例测序及同源比较。阳性者再扩增幽门螺杆菌(H.pylori, Hp)的特异基因相对分子质量(M_r)26×10~3的种特异性抗原和相关功能基因(CagA,VacA)。并采用免疫组化法检测食管癌组织中NF-κB p65蛋白的表达情况。结果32.5%(13/40)的食管癌组织中发现有螺杆菌16S rRNA基因存在,正常人食管组织无一例阳性。4例测序及同源比较,食管癌组织中螺杆菌序列与H.pylori的16S rRNA序列有99%～100%同源性。阳性标本均扩增出Hp特异基因M_r 26×10~3种特异性抗原,但仅2例扩增出CagA基因,3例扩增出VacA基因。免疫组化法染色显示,16S rRNA阳性的食管癌组织中NF-κB p65蛋白表达率为100%(13/13),而16S rRNA阴性食管癌组织表达率仅占18.5%(5/27),二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论食管癌患者食管组织存在螺杆菌感染,该螺杆菌可能为Hp。螺杆菌感染导致食管黏膜NF-κB p65蛋白表达的增加,可能在食管癌生成中作为信号传导机制之一。     

β-淀粉样蛋白真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建β-淀粉样蛋白真核表达质粒,为进一步开展老年性痴呆DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR扩增β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)基因,用限制性内切酶KpnⅠ/XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3.1酶切,将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切初步鉴定后进行序列测定。结果特异扩增出Aβ1-42片段,大小为126bp,片段成功插入pcDNA3.1载体中。经双酶切及序列测定结果表明Aβ1-42目的基因正确重组入pcDNA3.1载体中。结论成功构建Aβ1-42真核表达质粒。     

小鼠γ-干扰素真核表达质粒的构建和鉴定

目的克隆小鼠γ-干扰素(γ-IFN)基因,构建并鉴定小鼠γ-干扰素真核表达质粒.方法从BALB/c小鼠脾脏提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出小鼠γ-干扰素基因, 分别用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切扩增片段和pcDNA3.1(-),定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建成真核表达质粒pcDNA3.1(-)γ-IFN.转化产物通过PCR扩增筛选,双酶切鉴定;阳性克隆进行序列分析.结果 RT-PCR产物电泳可见一约500bp大小目的片段.PCR和双酶切电泳结果均证实已插入约500bp的γ-IFN基因片段;阳性克隆测序结果表明克隆的小鼠γ-干扰素基因完全正确.结论成功构建了小鼠γ-干扰素真核表达质粒,为进一步气道内实施哮喘小鼠基因治疗打下了坚实基础.     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.     

HCV非结构蛋白3真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3的构建

目的：构建HCV NS3基因真核表达载体，为进一步研究和解析HCV NS3基因诱发不死化人肝细胞癌化的机制准备了条件。方法：将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-3011质粒转化感受态菌JM109并扩增；提取pBRTM/HCV1-3011质粒；从pBRTM/HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV NS3片段；并将其插入到克隆载体pMD18-T中，再与表达载体pcDNA3.1(-)重组，以得到重组的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3；最后限制性酶切鉴定HCV NS3表达载体。结果：从pBRTM/HCV1-3011质粒中扩增出的HCV NS3片段大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3.1/NS3内。结论：成功地构建了HCV NS3基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3。     

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.     

T细胞白血病病毒1型Tax蛋白阳性细胞中早期生长反应基因-1对NF-κB活性的影响

目的 观察人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的Tax蛋白阳性细胞中早期生长反应基因-1(EGR-1)与NF-κB的关系.方法 RT-PCR扩增MT2细胞中EGR-1的cDNA全长,连接于真核表达载体pcDNA3.0;用脂质体介导的方法将pcDNA3.0-EGR-1转染TaxP/TaxN细胞,48 h后PCR检测EGR-1和p65 mRNA的表达,Western blot检测EGR-1及p65蛋白的表达;将pcDNA3.0-EGR-1和NF-κB报告基因共转染TaxP及TaxN细胞48 h后检测荧光素酶活性.结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-EGR-1,Tax可以促进EGR-1 mRNA和蛋白的表达;EGR-1可以促进TaxP细胞p65 mRNA和蛋白的表达,上调NF-κB活性.结论 EGR-1可能通过促进NF-κB活化参与成人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)的发病.

Abstract：

Objective To research the relation of early growth response gene-1(EGR-1) and NF-κB in human T-cell leukemia virus type 1(HTLV-1) Tax protein positive cells. Methods RT-PCR was used to amplify the aimed segments EGR-1 cDNA which was then inserted into an eukaryotic expression plasmid pcDNA3.0 to construct pcDNA3.0-EGR-1. The constructed plasmid was transfected into TaxN and TaxP cells by Tfx-50-mediated transfer method, the expression levels of EGR-1, p65 and Tax mRNA in transfected cells were assay by RT-PCR after 48 h post-transfection, the proteins of EGR-1 and p65 were detected by Western blot after 48 h post-transfection too. The constructed plasmid and pNF-κB-luc reporter gene plasmid was co-transfected into TaxN and TaxP cells by Tfx-50-mediated transfer method, and the activity of luciferase was assay after 48 h post-transfection. Results The results showed that the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.0-EGR-1 was successfully constructed. The mRNA and protein expression of EGR-1 could be promoted significantly by Tax. EGR-1 can promote the mRNA and protein expressions of p65 in TaxP cells, the activity of NF-κB was up-regulated by EGR-1 too. Conclusion EGR-1 maybe involve in adult T-cell leukemia(ATL) by increasing the activation of NF-κB.     

FSHR部分基因的真核表达质粒构建和生物信息学分析

目的克隆FSHR基因部分片段（145～330bp）（FSHRn）,构建真核表达重组质粒,预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性。方法提取小鼠睾丸组织的总RNA,利用RT—PCR技术反转录成cDNA,按照GenBank中小鼠FSHR N-端序列设计引物,扩增基因片段并插入pcDNA3．1／myc-His（-）B载体,重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定后用Vector NTI9．0软件作生物信息学分析。结果扩增片段长度为186bp,测序结果与已知序列吻合,重组真核表达质粒经PCR和双酶切鉴定获得正确重组子,生物信息学分析其编码蛋白抗原性肽段主要集中在15～20aa、22～27aa、32～36aa、42～48aa、58～67aa,与人的基因同源性为90％。结论成功克隆了FSHRn基因片段并构建了pcDNA3．1／FHSRn真核表达重组质粒;FSHRn具有良好的抗原性．FSHRn蛋白可作为良好的动物候选疫苗,为此段蛋白的深入研究和人类男性避孕疫苗的研制打下基础。     

人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1-PSCA,通过稳定转染建立高效表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,使用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组表达质粒pcDNA3.1-PSCA。双酶切及测序鉴定后,利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western blot检测PSCA在细胞系中的表达情况。结果:经测序及双酶切鉴定,pcDNA3.1-PSCA重组质粒构建正确;稳定转染人PSCA的B16细胞系表达率接近100%。结论:建立的稳定转染人PSCA的B16细胞系能够高效表达PSCA基因,为抗前列腺癌疫苗的功能研究奠定了基础。     

Trim6真核表达载体的构建及表达

目的:构建人Trim6的真核表达载体pcDNA3.1(+ )-Trim6,并观察其在HEK293T细胞中的表达.方法:提取HeLa细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim6编码区全长基因片段,克隆到pcDNA3.1(+),通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹检测Trim6蛋白的表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建人Trim6表达载体,该载体可以在HEK293T细胞细胞系中表达Trim6.结论:构建Trim6真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim6,为研究Trim6在固有免疫应答中的作用奠定了基础.     

hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达

目的:构建人类促甲状腺激素受体(hTSHR)胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf(aa29 ～100)、 hTSHRe(aa101～278)的真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe, 并在CHO细胞中进行表达.方法:RT-PCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5-His-TOPO中, 经酶切、 PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达, RT-PCR扩增转染细胞的cDNA、 Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达.结果:RT-PCR分别扩增两个片段的阳性克隆株, 所得片段大小与预期一致, 经Western blot鉴定, 相对分子质量(Mr)分别为11900、 23600左右, 与预期的大小相符.结论:真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe构建成功, RT-PCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达, 为进一步研究pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe在体内的基因表达, 建立Graves'病的动物模型奠定了基础.     

人UbcH10及其siRNA真核表达载体的构建与表达

目的：构建以人泛素结合酶UbcH10基因为基础的真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在结肠癌细胞LOVO中表达与鉴定。方法：提取组织总RNA,通过RT-PCR扩增出UbcH10基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中,构建UbcH10的真核表达载体。通过siRNA设计软件选取UbcH10基因的siRNA片段合成构建表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）。然后采用脂质体转染法将其分别转染LOVO细胞,用RT-PCR在RNA水平和Western Blot在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。结果：测序结果显示克隆UbcH10基因片段序列完全正确;重组质粒转染LO-VO细胞后,检测到pcDNA3.1（UbcH10）转染组UbcH10表达增强,而pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）转染组UbcH10表达减弱。结论：成功构建真核表达质粒pcDNA3.1（UbcH10）及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo（siRNA-UbcH10）,并在真核细胞中能有效表达,为今后进一步研究UbcH10的功能和作用机制奠定了基础。     

重组人β-防御素-2基因COS-7细胞的转染表达

目的通过构建两种SV40系列的重组载体,即N端带Flag标签的重组hBD-2基因和C端带Myc和6xHis双标签的重组hBD-2,并转染COS-7细胞,探索建立既能持续有效地表达和分泌hBD-2、其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线.方法与结果(1)将hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的上游带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,经DNA测序证明hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(2)hBD-2全长cDNA片段插入编码双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+),构建出C端带Myc和6xHis双重标签的重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.DNA测序结果表明hBD-2cDNA片段插入方向和全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(3)采用脂质体转染法分别将以上两种重组真核表达载体导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平分析hBD-2的表达情况.并检测经重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染细胞的可溶性蛋白及其培养上清的抗菌活性.(4)采用RT-PCR法对经带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,结果扩增出一条约240bp的cDNA片段,其大小与预测相符.经Westernblot法检测到细胞可溶性蛋白在约10kD处有强反应条带显示.(5)用特异性引物(hBD2p6/hBD2p7)对经pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染的COS7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,经Westernblot法检测到细胞蛋白在约10kD处有强反应条带显示,其大小与该重组质粒结构中由pCMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量(10.1)相符.双层肉汤琼脂平板扩散法抑菌试验结果表明分别与正常COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清比较,转染pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2的COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清在金黄色葡萄球菌质控菌株25923的平板上形成明显的抑菌环.结论(1)N端带Flag标签基因重组真核表达载体pCMV.tag2B/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法和Westernblot法证实hBD-2基因已在COS-7细胞内持续有效地表达.(2)C端带双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法、Westernblot法和体外抗菌实验证实,该系统不仅能有效地表达和分泌具抗菌活性hBD-2,也为其表达产物的检测、分离纯化提供了必要条件.     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白3对NF-κB信号通路的抑制作用

研究肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(A20)在病毒诱导的NF-κB信号通路中的调控功能.用TNF-α刺激RAW264.7细胞,获得其细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增鼠A20基因,经Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后插入pcDNA3.1-myc-His(-).经鉴定,将真核表达质粒pcDNA3.1-A20转染293T细胞....     

沉默NF-κB p65基因下调TNF-α诱导的肺泡上皮细胞的炎症反应

目的建立急性肺损伤体外细胞炎症模型,探讨NF-κB p65基因沉默减轻细胞炎症、保护肺结构细胞的可行性。方法以TNF-α(10 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549),运用RNA干扰技术沉默NF-κB p65基因,采用RT-PCR及Westernblotting法检测沉默效率,ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β、IL-8、IL-10等炎症因子浓度。结果 TNF-α刺激A549细胞可在基因水平上调NF-κB p65的表达,并增加NF-κB蛋白的核转位,上调细胞培养上清中IL-1β、IL-8、IL-10的浓度;预转染NF-κB p65 siRNA可在基因水平及蛋白水平有效沉默NF-κB p65表达,降低上述各炎症因子浓度(P<0.05)。结论急性肺损伤体外细胞炎症模型构建成功,RNA干扰技术能有效沉默该模型NF-κB p65基因,下调炎症反应水平,保护肺泡上皮细胞,为急性肺损伤免疫调控机制的研究和基因靶向治疗提供实验依据。     

EGFP-Sam68融合蛋白在HeLa细胞的表达和定位

目的克隆有丝分裂Src相关蛋白p68(Sam68)基因cDNA全长,构建Sam68真核绿色荧光蛋白表达载体,并确定其在HeLa中的表达和定位。方法提取HeLa细胞总RNA,RT-PCR扩增Sam68基因片段,经酶切鉴定及测序正确后,克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pcDNA3.0-EGFP)上,并转染HeLa细胞,Western blot法检测Sam68表达,免疫荧光细胞化学染色观察其细胞定位。结果酶切和测序证实Sam68正确插入pcDNA3.0-EGFP载体中,且载体正确表达了EGFP-Sam68融合蛋白,该蛋白定位在HeLa细胞核内。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-EGFP-Sam68。