HBV感染患者外周血单个核细胞HBV DNA和cccDNA的检测

目的 探讨乙型肝炎患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）能否感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）并进行复制。方法 选取 137例住院患者作为研究对象,采集血液标本,分离提取外周血单个核细胞,使用细胞甩片法固定细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（real-time quantitative polymerase chain reaction,QPCR）和滚环扩增结合原位跨缺口原位聚合酶链式反应技术检测HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）;免疫组织化学染色法检测HBV DNA和HBV cccDNA表达。结果 137例标本中,68.6%（94/137）的标本经免疫组化染色后检测出HBV DNA的表达;83.9%（115/137）的标本原位杂交和滚环扩增PCR后检出HBV cccDNA阳性信号;血清HBV DNA浓度高于106 copies/ml的患者PBMC中HBV cccDNA阳性率为95.1%,低于106 copies/ml的阳性率为51.4%。结论 高浓度外周血HBV DNA是HBV感染外周血单个核细胞的危险因素,通过原位聚合酶链式反应方法能够更灵敏地检测HBV DNA和cccDNA在PBMC中的表达,为进一步研究证实PBMC感染导致HBV母婴传播途径的分子机制奠定基础。     

慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞HBV感染后对其细胞免疫功能影响的研究

应用聚合酶链（PCR）方法检测慢性乙型肝炎（乙肝）病人外周血单个核细胞（PBMC）内乙肝病毒DNA （HBV DNA）。54例PBMC内HBV DNA （+）和71例PBMC内HBV DNA （-）病例平行测定自然杀伤细胞（NK）活性、T细胞亚群比值（CD₄/CD₈）和血清可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R）。结果示慢性乙肝病人PBMC内HBV DNA （+）组NK、CD₄/CD₈和sIL-2R与正常对照组及PBMC内HBV DNA （-）组病人相比差异均有非常显著性（P<0.001）。同时发现慢性乙肝PBMC内HBV DNA （+）病人NK活性、CD₄/CD₈比值和sIL-2R水平有直线相关性（P均<0.01），而PBMC内HBV DNA （-）病人，仅CD₄/CD₈比值和sIL-2R水平呈相关性（P<0.001） NK活性尚未受到明显影响。结果表明，HBV感染PBMC导致慢性乙肝病人细胞免疫功能紊乱，有助于阐明慢性乙肝的发病机制，并有可能为乙肝的防治提供理论依据。     

乙肝血清标记物阳性孕妇的胎盘组织和PBMC的HBVDNA检测及意义

为探讨乙型肝炎病毒（HBV）宫内感染的机理,本文采用原位分子杂交技术,测定了20份外周血HBsAg/HBeAg双阳孕妇胎盘组织和24份HBsAg阳性孕妇外周血单核细胞（PBMC）的HBV DNA,结果发现,胎盘组织HBV DNA均阳性;HBV DNA主要分布于胎盘蜕膜,而绒毛滋养层细胞未见阳性,提示HBV已侵袭胎盘蜕膜,且可能在蜕膜细胞中有复制,但未累及绒毛,PBM HBV DNA测定结果表明,HBV DNA阳性率为58．3％（14／24）,阳性的孕妇中,有2例其婴儿发生了宫内感染。     

人外周血单个核细胞的乙型肝炎病毒感染

众多研究表明,HBV很可能经受体介导而感染外周血单个核细胞(PBMC),并可在PBMC中完成病毒复制周期。HBV DNA在PBMC中主要以游离和整合两种形式存在。对肝细胞和PBMC中HBV相关标志的比较,表明两者虽有相关性,但尚未证明有直接或因果关系。对PBMC的HBV感染的研究有助于解释乙型肝炎患者免疫系统的异常,指导治疗和防止HBV感染的传播。     

PBMC中HBV cccDNA与HBV宫内感染关系的研究

目的：对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)进行扩增，并对其产物直接测序鉴定，以证实PBMC为HBV肝外复制的场所，从而进一步证实PBMC感染为乙型肝炎宫内感染的途径之一。方法：选择性PCR扩增PBMC中HBV cccDNA，并对1例阳性产物直接测序鉴定，测序结果与GeneBank中已知序列进行同源性比较。结果：HBsAg阳性孕妇PBMC HBV cccDNA的检出率为9．93％，新生儿PBMC HBV cccDNA的检出率为4．58％，PBMC HBV cccDNA与公布的已知序列的同源性为100％。结论：PBMC为HBV肝外复制的场所，PBMC感染很可能是乙肝宫内感染的传播机制之一。     

外周血单个核细胞中TTV-DNA检测及意义

目的：探讨外周血单个细胞（PBMC）中输血传播病毒（TTV）的检测意义。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法检测49例血液透析患者血清及PBMC中TTV－DNA。结果：血液透析患者TTV感染率18．4％（9／49）。PBMC中TTV－DNA检出率22．4％（11／49），PBMC中TTV－DNA检出率在血清TTV－DNA阳性者（66．7％），高于血清TTV－DNA阴性者（12．5％）（P＜0．05）。结论：PBMC中TTV－DNA主要在血清阳性患者中检出，PBMC可能是TTV的一个贮存场所。     

母血HBV DNA含量与新生儿HBV感染关系

目的 探讨HBsAg阳性孕妇外周血乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量及细胞转运与新生儿HBV感染的关系.方法 用荧光定量PCR方法定量检测HBsAg阳性孕妇血清HBV DNA;用等位基因特异性PCR及半巢式PCR技术扩增HBsAg阳性孕妇新生儿外周血中母亲DNA,通过检测谷胱甘肽-S-转移酶(GSTM1)、血管紧张素转换酶(ACE)等位基因确定母-胎细胞转运;用巢式PCR检测新生儿血清、外周血单个核细胞(PBMC)中HBV DNA.结果 随着孕妇血清HBV DNA含量的增加,新生儿HBV DNA阳性的危险性呈现增高趋势(X~2=13.16,P<0.05,趋势X~2=12.42,P<0.05),而孕妇血清HBV DNA含量与新生儿PBMC HBV DNA阳性无关(总X~2=2.41,P>0.05,趋势X~2=0.35,P>0.05);孕妇血清HBV DNA含量与母-胎细胞转运无关(总X~2=4.14,P>0.05,趋势X~2=0.001,P>0.05);母-胎细胞转运与新生儿外周血PBMC HBV DNA阳性有关(X~2=10.26,P<0.05),而与新生儿外周血HBV DNA阳性无关(X~2=0.49,P>0.05).结论 HBsAg阳性孕妇血清HBV DNA含量、母-胎细胞转运与新生儿HBV感染有关,分别是新生儿血清、PBMC HBV感染的重要危险因素.     

多重PCR法检测外周血单个核细胞中的HBVDNA与HBVcccDNA

目的建立多重聚合酶链反应法(Multiplex Polymerase chain reaction，M—PCR)，揭示慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)中HBVDNA的存在状况。方法采用一种把一套扩增乙肝病毒基因组DNA(HBV genome DNA)的引物和一套特异性扩增乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBVcccDNA)的引物掺入到一个体系中的PCR法，检测PBMC中的HBVDNA核酸分子。结果PCR法可使处于同一PBMC中的总HBVDNA和HBVcccDNA同时分别良好的扩增出来；30例慢性乙肝患者的PBMC中，总HBVDNA与HBVcccDNA同耐检出者23例，检出率76．6％；检出HBVcccDNA者占检出总HBVDNA者的82．1％。结论PBMC中的HBVDNA部分参与复制。成功的建立了能同时检测HBV基因组DNA与HBVcccDNA的M—PCR方法。     

套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBV cccDNA

目的：建立套式聚合酶链反应法（nPCR）检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）。方法：根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列，设计两套相对保守的引物，建立HBV cccDNA套式PCR，并用该法检测200例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA。结果：该法检测200例慢性乙型肝炎患者，HBV cccDNA阳性率为60％。结论：套式PCR法简便、灵敏，可用于测定PBMC中HBV cccDNA。     

HBsAg阳性孕妇新生儿外周血单个核细胞乙型肝炎病毒感染状况及意义的研究

目的了解乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性孕妇新生儿外周血单个核细胞(PBMC)乙型肝炎病毒(HBV)感染状况及其在HBV宫内感染中的意义.方法用原位杂交(ISH)和原位PCR(IS PCR)法对HBsAg阳性孕妇新生儿PBMC进行HBV DNA检测.用随机引物法进行地高辛-HBVDNA探针的标记和定量.结果ISH及IS PCR检测PBMC HBV DNA,探针浓度以0.6μg/ml、蛋白酶K浓度以10μg/ml、IS PCR以20个循环数为佳.HBsAg阳性孕妇新生儿中,血清HBsAg、HBVDNA均阳性者有72.73%PBMC HBV DNA阳性;HBsAg阴性、HBV DNA阳性者中,有65.91%PBMC HBV DNA阳性;血清HBsAg、HBV DNA均阴性者中,仍有15.79%PBMC中HBV DNA阳性.结论IS PCR检测对低丰度PBMC HBV DNA具有细胞内定性和定位的特点.血清HBV DNA阳性新生儿多数可检出PBMC HBV DNA,而血清HBV DNA阴性新生儿也可呈PBMC HBV DNA阳性.提示PBMC HBV感染应作为HBV宫内感染的诊断指标之一.     

母胎细胞转运与乙型肝炎病毒宫内感染关系的研究

目的探讨母胎细胞转运与乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的关系。方法用STRPCR、As-PCR及hemi-nPCR技术扩增HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血中胎儿DNA及母亲DNA，通过检测TH01、GSTM1、ACE等位基因确定母．胎细胞转运与胎．母细胞转运。采用巢式病例对照研究方法分析母-胎细胞转运与HBV宫内感染的关系。结果以GSTM1、ACE基因多态性判定母亲源性或胎儿源性等位基因，42对信息病例中有26例新生儿发生了母．胎细胞转运(61．90％，26／42)；40对信息病例中有32例发生了胎-母细胞转运(80．00％，32／40)；10对母胎发生了双向转运。统计分析显示母-胎细胞转运与HBV宫内感染有关联，胎．母细胞转运与HBV宫内感染无关联，母-胎细胞转运与胎-母细胞转运无关。母-胎细胞转运、孕妇PBMC HBV DNA阳性是HBV宫内感染的危险因素，二者未显示交互作用；母-胎细胞转运、孕妇PBMC HBV DNA阳性与新生儿PBMC HBV感染有关，两因素间亦未显示交互作用。结论母胎之间存在细胞转运，母-胎细胞转运是HBV宫内感染的危险因素，这可能是对HBV宫内感染途径的补充。     

两种不同方法检测乙肝病毒血清学标志物比较及其临床意义

目的比较两种不同检测方法FQ-PCtL和ELISA定性检测HBVM及其临床意义。方法对106例乙肝病毒血清同时进行FQ—PCK检测HBV-DNA及ELISA方法测定HBVM。结果不同的血清学模式，HBV—DNA阳性率有差异，其中HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、g-HBc（＋）和HBsAg（＋）、抗-HBe（＋）、抗-HBc（＋）模式的HBV—DNA阳性率高。结论FQ—PCIL检测患者血清HBV—DNA含量可以准确地反映HBV的感染状态和复制情况，具有较高的临床应用价值。     

慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞HBV感染后对其细胞免疫功能影响的研究

应用聚合酶链（PCR）方法检测慢性乙型肝炎（乙肝）病人外周血单个核细胞（PBMC）内乙肝病毒DNA（HBVDNA）。54例PBMC内HBVDNA（＋）和71例PBMC内HBVDNA（－）病例平行测定自然杀伤细胞（NK）活性、T细胞亚群比值（CD4／CD8）和血清可溶性白细胞介素2受体（sIL－2R）。结果示慢性乙肝病人PBMC内HBVDNA（＋）组NK、CD4／CD8和sIL－2R与正常对照组及PBMC内HBVDNA（－）组病人相比差异均有非常显著性（P＜0．001）。同时发现慢性乙肝PBMC内HBVDNA（＋）病人NK活性、CD4／CD8比值和sIL－2R水平有直线相关性（P均＜0．01），而PBMC内HBVDNA（－）病人，仅CD4／Cd8比值和sIL—2R水平呈相关性（P＜0．001）NK活性尚未受到明显影响。结果表明，HBV感染PBMC导致慢性乙肝病人细胞免疫功能紊乱，有助于阐明慢性乙肝的发病机制，并有可能为乙肝的防治提供理论依据。     

Caspase-9活性检测在慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡中的意义

目的探讨慢性乙型肝炎(乙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)凋亡率在乙肝病毒(HBV)感染慢性化机制中的意义及凋亡PBMC的半胱氨酸基-天冬氨酸特异性蛋白酶9(Caspase-9)活性在PBMC凋亡过程中的意义。方法采用流式细胞仪检测25例慢性乙肝患者及15例健康对照者PBMC的凋亡率,并用比色法检测凋亡PBMC内Caspase-9的活性。结果慢性乙肝患者HBV DNA阳性组PBMC凋亡率及PBMC内Caspase-9活性均高于HBV DNA阴性组(均P<0.01)及健康对照组(均P<0.01),HBV DNA阴性组上述两指标均高于健康对照组(分别P<0.05;P<0.01)。慢性乙肝患者PBMC中Caspase-9活性与其凋亡率呈正相关(P<0.01)。结论慢性乙肝患者PBMC存在凋亡现象,可能为乙肝慢性化机制之一;其中的Caspase-9活性增高,提示Caspase-9可能参与了慢性乙肝患者PBMC的凋亡过程。     

438例HBsAg(+)者病毒水平分析

血清中HBsAg（＋）是HBV感染的主要标志。HBsAg滴度高低、HBV的量的水平和乙型肝炎的病情及其防治有密切的联系。因此，了解HBV的量及其变化具有十分重要的意义。当前只能间接地检测HBV血清免疫学标志物及HBV—DNA，借此了解病毒水平。现将市疾控中心2004—2005年健康查体检出的438例HBsAg（＋）者研究分析，旨在了解HBV的抗原、抗体和HBV—DNA分布的质与量，为阐明HBV在人体内的复制、消亡提供依据。     

HBV感染外周血单个核细胞的临床意义

HBV可感染外周血单个核细胞并在细胞内复制。HBV感染外周血单个核细胞与隐性HBV感染有关；与围产期母婴传播相关；影响机体体液免疫及细胞免疫状态，使HBV持续感染；也与病情的轻重及反复有关。     

外周血单个核细胞感染乙型肝炎病毒对新生儿宫内感染的影响

目的探讨HBsAg、HBeAg阳性孕妇外周血单个核细胞(PBMC)内乙型肝炎病毒(HBV)DNA感染状况及其在宫内母婴垂直传播中的作用.方法对HBsAg/HBeAg双阳性共67对孕妇及其新生儿静脉血分离和提纯PBMC后,经抽提、纯化后的DNA进入PCR扩增反应,引物为HBV C区基因序列.结果67例HBsAg及HBeAg双阳性的孕妇中有35例(52.2%)PBMC中HBV DNA阳性,25例孕妇在血清及PBMC中均发现HBV DNA.67例新生儿有22例感染HBV DNA,感染率32.8%,其中血清HBV DNA阳性者10例,PBMC HBV DNA阳性者19例,二者均阳性者7例.结论母亲PBMC内HBV DNA阳性可能导致新生儿PBMC中HBV DNA阳性,PBMC内的HBV DNA可能是HBV母婴垂直传播的一条重要途径,同时,HBsAg及HBeAg阳性母亲若血清HBV DNA为阳性就极大增加了其新生儿感染HBV的危险性.     

T淋巴细胞对HBV反应能力的比较研究HIV感染急性期及慢性期

目的　探索HIV感染急性期及慢性期T淋巴细胞对HBV反应能力的差异。方法　入组合并HBV感染的HIV感染急性期患者10例,合并HBV感染的HIV感染慢性期患者15例,分析HBV DNA与HIV RNA及CD4+ T细胞之间的相关性;收集患者的外周血单个核细胞,用HBsAg重叠肽刺激培养后检测CD4+ T细胞及CD8+ T细胞分泌IFN-γ的能力。结果　HBV DNA水平与HIV RNA水平呈正相关（r=0.502,P=0.011）,HBV DNA水平与CD4+ T细胞计数呈负相关（r=-0.409,P=0.042）。HIV感染急性期患者经HBsAg重叠肽刺激后CD4+ T细胞及CD8+ T细胞分泌IFN-γ的能力（分别为9.1%±3.9%及4.4%±1.8%）明显高于HIV感染慢性期患者（分别为5.7%±2.5%及2.7%±1.4%）。结论　HIV合并HBV感染的患者在HIV感染急性期对HBV的清除能力明显高于HIV感染慢性期,本研究为探究HIV感染不同时期对HBV清除能力差异提供了证据。     

HBV肝外复制的意义

HBV及类似的动物DNA病毒属嗜肝病毒,即病毒的复制和所引起的细胞损害主要限于肝脏。然而,最近的研究提示,HBV可以在肝细胞以外的组织中复制,但肝外复制的意义尚未阐明。哺乳动物和鸟类嗜肝病毒的发现为体内研究HBV感染提供了优良而经济的模型。在肝外嗜肝病毒复制的最初报道之后,又有许多有关病毒感染部位的研究。Hal-pern等发现在感染鸭的胰和肾中有鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA的复制中间体,即聚腺苷酸化DHBV RNA和病毒抗原。复制中间体的存在提示,DNA并不是因血源污染所致,而是细胞内活跃复制产生。聚腺     

慢性乙型肝炎患者血清中HBeAg水平与HBV—DNA载量的相关性分析

目的研究慢性乙型肝炎病毒感染者中HBeAg水平及其HBV—DNA载量的相关性及临床意义。方法用荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）精确定量,检测319例慢性乙型肝炎患者血清中HBV—DNA含量;以化学发光标记免疫法配对检测其血清HBeAg水平。结果不同HBeAg水平对应的HBV—DNA载量有所不同。HBeAg1—50（s/co）组的患者其HBV—DNA载量高于0～1（s／co）（即阴性组）,但这种差异无统计学意义（P〉0．05）。将HBeAg水平〉50（s／co）组患者的HBV—DNA与1～50（s／co）组及0～1（s／co）阴性组比较,发现前者血清HBV—DNA载量明显高于后者（P〈0．05）。结论HBV—DNA载量与HBeAg含量之间有一定的相关性,但也不完全一致;在低水平HBeAg的患者中,其血清仍有一定的HBV—DNA检出率,临床、流行病学上仅以HBeAg作为复制的血清指标,来判断HBV复制和评估传染性有明显的局限性,临床应结合HBV—DNA与HBeAg水平综合判断HBV复制程度。以指导治疗。