肠道菌群对凡纳滨对虾健康的指示作用

高密度、集约化的凡纳滨对虾养殖常伴随病害的发生,但还不能确定能否利用对虾的肠道细菌差异来指示其健康状况.因此,我们分别采集了健康和发病养殖塘水样和对虾样品,利用Illumina MiSeq测序技术测定细菌16S rRNA基因,研究细菌的群落结构和多样性.结果表明： 细菌群落结构变异主要受水体中亚硝酸盐、叶绿素a和磷酸盐的影响.发病对虾肠道细菌群落多样性显著低于健康对虾.在健康和发病对虾肠道细菌中,运用响应比分析,我们筛选到了28个丰度差异显著的分类操作单元(OTUs),其中来源于放线菌纲、黄杆菌纲和芽孢杆菌纲的OTUs丰度在发病对虾肠道中显著降低,而隶属于梭状芽孢杆菌纲的OTUs丰度在发病对虾肠道显著增加.此外,我们挑选出61个指示物种,主要属于拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、浮霉菌门和放线菌门.值得注意的是,它们能够区分样品的来源(水样或虾肠道)和健康状态.本研究为对虾病害预测和益生菌开发提供了理论依据.     

肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道和肝胰腺菌群的影响

利用16S rRNA高通量测序对比研究了健康对虾和感染肝肠胞虫的发病对虾肠道及肝胰腺菌群的组成、多样性、微生物介导的功能和种间互作间的差异性。结果表明,健康对虾的肠道和肝胰腺细菌群落的多样性高于发病对虾。在属水平上,健康对虾和发病对虾的肠道及肝胰腺中的优势细菌组成及丰度存在明显不同,其中健康对虾肠道中的优势菌属主要为埃希杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)和海绵菌属(Spongiimonas),而发病对虾肠道中的优势菌属则为希瓦式菌属(Shewanella)、巨球型菌属(Megasphaera)和克雷伯氏菌属(Klebsiella);健康对虾肝胰腺中的优势菌属主要为假单胞菌属(Pseudomonas)和汉氏盐单胞菌(Halomonas),而发病对虾肝胰腺中的优势菌属则为贪铜菌属(Cupriavidus)。Tax4Fun2预测显示,健康对虾肠道和肝胰腺菌群的主要功能分别与发病对虾肠道和肝胰腺菌群的主要功能有明显差异。研究有助于了解肝肠胞虫对凡纳滨对虾肠道及肝胰腺细菌群落的影响,并为凡纳滨对虾的健康管理和养殖提供依据。     

蝇蛆蛋白粉对凡纳滨对虾生长的影响

设计了4种实验饲料(ABCD)并进行了8周饲养试验来评定添加蝇蛆粉对凡纳滨对虾生长性能的影响.以实用饲料D作为对照组,ABC是在D的基础上,分别以5%,10%和15%的蝇蛆粉替代鱼粉.养殖试验结束后,分别计算体长、全长和背甲宽等生长性能.实验结果显示,AB组凡纳滨对虾的生长性能与对照组差异不显著(P>0.05).C组与对照组差异极显著(P<0.01).结果表明,饲料中添加适量的蝇蛆蛋白粉对凡纳滨对虾有一定的促生长作用,可用适量的蝇蛆蛋白粉替代对虾配合饲料中的部分鱼粉.     

凡纳滨对虾红体病病原

2001年7月辽宁省盘锦市大洼对虾养殖厂凡纳滨对虾大面积暴发红体病。主要表现为全身发红,活动减弱,食欲减退,壳变硬,死亡率高等。本研究从患红体病的凡纳滨对虾肌肉组织中分离到三株优势菌,经回归感染证实其中一株为引发本次凡纳滨对虾红体病的病原菌,编号为0107。对该菌进行了生理生化鉴定和16SrRNA基因序列同源性分析,将其判定为副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)。药敏实验结果显示,该菌对头孢哌酮、头孢曲松等多种抗生素敏感,对氨苄西林、青霉素等抗生素不敏感。     

凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的超微结构

利用电镜研究凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的全过程。结果表明 :凡纳滨对虾卵黄的发生是双源性的。卵黄发生早、中期是内源性卵黄大量合成的阶段 ,卵黄发生中、后期则以外源性卵黄的合成为主。内源性卵黄主要由内质网、线粒体、核糖体、溶酶体、高尔基器等多种胞器活跃参与形成。其中数量众多的囊泡状粗面内质网是形成内源性卵黄粒的最主要的细胞器 ;部分线粒体参与卵黄粒的合成并自身最终演变为卵黄粒 ;丰富的游离核糖体合成了大量致密的蛋白质颗粒并在卵质中直接聚集融合成无膜的卵黄粒 ;溶酶体通过吞噬、消化内含物来形成卵黄粒和脂滴 ,且方式多样 ;高尔基器不直接参与形成卵黄粒。外源性卵黄主要通过卵质膜的微吞饮活动从卵周隙或卵泡细胞中摄取外源物质来形成     

凡纳滨对虾繁育系统菌群结构及优势菌遗传多样性分析

【目的】探讨凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化繁育系统内发生细菌性玻化症(shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome,BVS)时期可培养微生物的菌群特征以及优势病原菌的遗传多样性。【方法】采用细菌体外培养方法结合基因测序技术对不同育苗阶段的亲虾、受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾,及其育苗池水和饵料内可培养细菌菌群的组成与结构特征进行研究,并通过多位点序列分析(multilocus sequence analysis,MLSA)方法解析病原菌的遗传多样性。【结果】系统内分离纯化的526株具有典型形态差异和群落优势的细菌分属于4门5纲16目24科38属113种。在纲水平上γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)丰度最高,共453株,占总分离株的86.1%;在属水平上弧菌属(Vibrio)丰度最高,共369株,占总分离株的70.2%;在种水平上,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为最优势种,共112株,占总分离株的21.3%,并且分布于整个繁育系统,在饵料中具有最高丰度。多元关联分析表明,随着对虾幼体的发育,饵料对幼体体内可培养细菌的菌群结构影响逐渐增加。对112株潜在溶藻弧菌的MLSA分析表明,其中100株菌株进一步确认为溶藻弧菌。进一步利用MLSA构建系统发育树分析其遗传多样性发现,100株溶藻弧菌分为9个簇,分离自同类样品的菌株广泛分布在不同的簇中。【结论】在BVS发生时期,凡纳滨对虾工厂化繁育系统中具有丰富的可培养微生物种类。对虾幼体发育过程中,饵料对幼体体内可培养细菌的菌群结构具有重要影响。溶藻弧菌为凡纳滨对虾工厂化繁育系统中的优势弧菌,分布于整个繁育系统,且具有丰富的遗传多样性。本研究为解析对虾繁育系统可培养微生物演替规律提供了数据支撑,也为对虾苗期病原防控和健康养殖提供了科学依据。     

凡纳滨对虾对吉林西部盐碱水的适应性

采用淡化虾塘水添加天然盐碱水的方法,进行盐碱水环境下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生存能力实验,探讨吉林西部盐碱水域对虾养殖技术.结果表明,未驯化幼虾在碱度为515～19.24 mmol·L^-1的盐碱水体存活时间大于96 h,在23.41～38.78 mmol·L^-1的盐碱水体生存时间小于0.75 h;驯化幼虾在碱度为5.15～38.78 mmol·L^-1的盐碱水体存活时间大于24 h.未驯化幼虾适应的盐碱水碱度上限在10 mmol·L^-1左右,对递增碱度差的适应能力小于8 mmol·L^-1.提高驯化水平,可增强幼虾对盐碱水环境的综合适应能力.碱度驯化至30 mmol·L^-1的幼虾对递增碱度差和递减碱度差的适应能力分别为2～4 mmol·L^-1及3～25 mmol·L^-1,可以在吉林西部碱度小于32 mmol·L^-1的盐碱水域养殖凡纳滨对虾.     

环境因子对凡纳滨对虾性别分化的影响

通过外部形态观察和组织学连续切片,探讨温度(251)℃、(291)℃和(331)℃、光照周期(6L∶18D、12L∶12D、18L∶6D和24L∶0D)、光照强度(800、3000和5000 lx)、盐度(10、20、30和40)和环境雌激素壬基酚(40、80和120g/L)对凡纳滨对虾仔虾性别分化的影响。结果表明:温度和光照对凡纳滨对虾性别比例无显著影响(P0.05),但显著地影响性分化时间;10、20和40盐度组以及120g/L的壬基酚处理组的凡纳滨对虾雌雄比分别为0.81∶1,0.67∶1,1.29∶1和1.24∶1,显著偏离1∶1的性别比例,且盐度和壬基酚处理也影响性腺分化时间。此外,凡纳滨对虾触鞭长与体长之比1.0时与其性腺及外部形态分化时期相一致,提示可以将触鞭长与体长之比1.0作为判定凡纳滨对虾性分化开始的指标。       

维生素C对凡纳滨对虾生长及抗病力的影响

以不同水平维生素C 2 磷酸酯 (添加量分别为 0、75、15 0、30 0和 6 0 0mg/kg)的饲料喂养凡纳滨对虾 10周 ,研究维生素C 2 磷酸酯对凡纳滨对虾生长及抗病力的影响。结果显示 :在养殖前 4周 ,饲料中添加维生素C 2 磷酸酯显著促进凡纳滨对虾的生长 ,然而对对虾的成活以及饲料利用不产生影响 (P >0 0 5 ) ;而到实验后期添加维生素C 2 磷酸酯不能促进凡纳滨对虾的生长 ,却显著提高凡纳滨对虾的成活率 (P <0 0 5 )。维生素C 2 磷酸酯对对虾体水分、脂肪、蛋白质和维生素C在肝胰脏中的积累量的影响显著 (P <0 0 5 ) ,对对虾体灰分影响不显著 (P >0 0 5 )。维生素C 2 磷酸酯对对虾血清中超氧化物歧化酶活力无显著影响 ,饲料中未添加维生素C或过量添加 (超过 30 0mg/kg饲料 )均导致血清中酚氧化酶活力、血细胞总数和溶菌酶活力的显著下降。以生长、成活和酚氧化酶活力为指标 ,饲料中维生素C 2 磷酸酯的适宜添加量为 15 0mg/kg。     

酵母葡聚糖衍生物对凡纳滨对虾血细胞免疫反应的影响

酵母葡聚糖是水产养殖中使用最广泛的免疫增强剂之一,但其不溶解性不利于其免疫增强作用的发挥。为了增加酵母葡聚糖的溶解性,研究共制备了8种酵母葡聚糖衍生物,即4种不同取代度的羧甲基葡聚糖和磺乙基葡聚糖。将葡聚糖和其8种衍生物分别按照5、25和100 g/mL的浓度分别添加到原代培养凡纳滨对虾血细胞的培养液中。以空白血细胞作为对照。孵育6h、12h和24h后分别取样,测定血细胞的酚氧化酶和呼吸暴发活力。结果表明,在6h时,所有葡聚糖衍生物处理组的酚氧化酶活力均显著高于相同浓度下的未衍生葡聚糖处理组（P0.05）。而25 g/mL酵母葡聚糖衍生物处理组的呼吸暴发活力显著高于同浓度未经衍生葡聚糖处理组（P0.05）。在12h时,所有酵母葡聚糖衍生物处理组的酚氧化酶和呼吸暴发活力均显著高于未衍生葡聚糖处理组（P0.05）。在6h和12h时,同浓度各葡聚糖衍生物处理组的血细胞酚氧化酶和呼吸暴发活力并无显著差异（P0.05）。研究结果表明,羧甲基葡聚糖和磺乙基葡聚糖均比未衍生葡聚糖具有更强的免疫促进作用,而且这种免疫促进作用在两种衍生物之间没有显著差异;另一方面,酵母葡聚糖衍生物的免疫促进作用与其使用浓度有关,而与其取代度没有明显的关系。       

两种微藻对凡纳滨对虾幼体成活率的影响

试验旨在研究钝顶螺旋藻(Sprinulian platensis)和Picochlorum sp.两种微藻培育凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体效果, 为开发凡纳滨对虾开口饵料提供参考依据。实验对照组D0 投喂商品螺旋藻粉, 实验组D1、D2 分别投喂钝顶螺旋藻和Picochlorum sp., 每组3 个重复,每个重复2 万尾凡纳滨对虾幼体, 在300 L 育苗桶中饲养七天。 结果表明, D0 和D1 组间凡纳滨对虾存活率无显著差异(P＞0.05), 但两组极显著高于D2 组(P＜0.01)。在凡纳滨对虾育苗过程中, 水体总氨氮浓度小于50 umol·L^-1、亚硝酸盐氮浓度小于2 umol·L^-1。钝顶螺旋藻可以保证较高的幼体变态存活率, 可以作为凡纳滨对虾开口饵料新资源开发利用。     

凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶同源性分析

以凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei shrimp) 虾头为原料,采用Q- Sepharose F F和Sephadex G-150对虾头内源碱性蛋白酶进行了纯化,通过SDS-PAGE测定分子量为79.95 kD|采用DEAE-Sepharose F.F和Sephadex G-100对内源酸性蛋白酶进行了纯化,通过SDS-PAGE测定分子量为27.45 kD. 利用HPLC-ESI-MS/MS对虾头内源碱性和酸性蛋白酶同源性进行了初步分析,将检测到内源性蛋白酶的部分氨基酸序列分别与不同物种的胰蛋白酶和胃蛋白酶氨基酸序列于Vector NTI suite 8.0软件上进行序列比对. 结果表明,内源性碱性蛋白酶与猪胰蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列LSSPATLNSRVATVSLPR|内源性酸性蛋白酶与非洲蟾蜍胃亚蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列EFGLSETEPGTNF.     

一株凡纳滨对虾源鳗弧菌群体感应信号分子的检测

旨在检测从凡纳滨对虾体内选取的一株鳗弧菌的群体感应信号分子。利用报告菌株结合薄层层析法鉴定鳗弧菌(Vibrio anguillarum,VA)分泌的高丝氨酸内酯类(AHLs)信号分子,利用哈维氏弧菌V.harveyi JMH597和V.harveyi JAF375作为报告菌株分别检测了VA分泌的AI-2和CAI-1信号分子活性与细菌密度的关系。结果表明,VA能分泌3种类型的信号分子:AHLs信号分子、AI-2信号分子和CAI-1信号分子,其中分泌的AHLs有N-3-羟基-己酰基-高丝氨酸内酯(3-OH-C6-HSL)、N-3-辛酰基-高丝氨酸内酯(C_8-HSL)和N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯(3-oxo-C_8-HSL)。VA分泌的AHLs、AI-2和CAI-1均具有密度依赖性。     

凡纳滨对虾肠道红杆菌科细菌富集碳源筛选及其定向分离

【目的】红杆菌科(Rhodobacteraceae)细菌为凡纳滨对虾肠道微生物的优势类群,在健康对虾肠道中具有较高的相对丰度,是指示对虾健康的关键类群,探究对虾肠道红杆菌科细菌定向富集和分离方法,可为对虾养殖益生菌菌剂的研发提供基础。【方法】利用16S rRNA基因高通量测序技术研究不同碳源添加对凡纳滨对虾肠道中红杆菌科细菌的富集作用,筛选对红杆菌科细菌有显著富集作用的碳源;利用纯培养技术从红杆菌科细菌富集的样品中定向分离红杆菌科细菌,并对其进行鉴定和遗传多样性分析。【结果】添加短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)和碳酸氢钠对红杆菌科细菌有显著富集作用,主要富集到Cribrihabitans、Tritonibacter、Rhodovulum、Ruegeria、Sagittula和Thalassobius属相关菌株;对红杆菌科细菌相对丰度最高的样品进行稀释涂布培养,共分离纯化出303株细菌,分属于2门12科,其中红杆菌科细菌为主导类群共119株,主要包括Tritonibacter (90株)、Phaeobacter (25株)、Sulfitobacter (1株)、Ruegeria (1...     

凡纳滨对虾繁育系统菌群结构及优势菌遗传多样性分析北大核心

【目的】探讨凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化繁育系统内发生细菌性玻化症(shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome,BVS)时期可培养微生物的菌群特征以及优势病原菌的遗传多样性。【方法】采用细菌体外培养方法结合基因测序技术对不同育苗阶段的亲虾、受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾,及其育苗池水和饵料内可培养细菌菌群的组成与结构特征进行研究,并通过多位点序列分析(multilocus sequence analysis,MLSA)方法解析病原菌的遗传多样性。【结果】系统内分离纯化的526株具有典型形态差异和群落优势的细菌分属于4门5纲16目24科38属113种。在纲水平上γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)丰度最高,共453株,占总分离株的86.1%;在属水平上弧菌属(Vibrio)丰度最高,共369株,占总分离株的70.2%;在种水平上,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为最优势种,共112株,占总分离株的21.3%,并且分布于整个繁育系统,在饵料中具有最高丰度。多元关联分析表明,随着对虾幼体的发育,饵料对幼体体内可培养细菌的菌群结构影响逐渐增加。对112株潜在溶藻弧菌的MLSA分析表明,其中100株菌株进一步确认为溶藻弧菌。进一步利用MLSA构建系统发育树分析其遗传多样性发现,100株溶藻弧菌分为9个簇,分离自同类样品的菌株广泛分布在不同的簇中。【结论】在BVS发生时期,凡纳滨对虾工厂化繁育系统中具有丰富的可培养微生物种类。对虾幼体发育过程中,饵料对幼体体内可培养细菌的菌群结构具有重要影响。溶藻弧菌为凡纳滨对虾工厂化繁育系统中的优势弧菌,分布于整个繁育系统,且具有丰富的遗传多样性。本研究为解析对虾繁育系统可培养微生物演替规律提供了数据支撑,也为对虾苗期病原防控和健康养殖提供了科学依据。     

循环水养殖系统中凡纳滨对虾肠道微生物对三种复合益生菌制剂的响应

【目的】在循环养殖系统中应用不同的复合益生菌制剂,探讨凡纳滨对虾肠道菌群结构特征及免疫水平发生的变化。【方法】30 d养殖周期结束后,通过平板计数法分析肠道细菌总数和弧菌总数;基于高通量测序技术分析肠道样品V3+V4区菌群特征;采用实时荧光定量PCR技术分析免疫相关因子TLR1和Dorsal基因表达水平,阐述益生菌制剂应用的意义。【结果】益生菌制剂的应用降低了凡纳滨对虾肠道中细菌总数,抑制弧菌的生长,间接预防疾病的发生。不同益生菌制剂从不同程度上优化了凡纳滨对虾肠道菌群结构,提高高质量序列和有效OTU数量,Chao1、Simpson、Shannon指数显示了丰富度和多样性变化,复合益生菌制剂3效果较好。同时,菌群结构得到优化,其中益生菌制剂1组对拟杆菌门含量百分比产生显著影响。Toll受体TLR1和Toll通路中的Dorsal基因m RNA表达受到益生菌制剂的影响,1、3组促进了TLR 1表达,1、2、3组都促进了Dorsal基因表达。【结论】在循环水养殖系统中添加益生菌制剂可优化凡纳滨对虾肠道菌群特征,提高免疫水平,为病害防控和健康养殖提供理论依据。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白与病原菌凝集作用靶标的鉴定

血蓝蛋白是一种具有多种非特异性免疫学活性的多功能蛋白,以前的研究发现,血蓝蛋白具有凝集活性.本研究采用凝集抑制实验和亲和蛋白质组学等方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白与病原菌的凝集作用靶标.结果显示,大肠杆菌K12和副溶血弧菌外膜蛋白可以抑制血蓝蛋白对7种细菌的凝集活性,其中大肠杆菌K12中2种分子质量分别为16 kD、18 kD （命名为 p16、p18）的外膜蛋白可以与血蓝蛋白发生特异性的结合,经MALDI-TOF/MS鉴定,p16、p18 分别与大肠杆菌外膜蛋白OmpC、OmpX具有高度同源性.尤其是与大肠杆菌K12野生菌株相比,血蓝蛋白对 ΔOmpX 的凝集特异性明显降低,后者仅为前者的25％.由此推测,OmpX 应为血蓝蛋白与病原菌的凝集作用靶标.     

凡纳滨对虾β-actin基因的克隆与表达

目的:克隆凡纳滨对虾肌动蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法:根据GenBank上凡纳滨对虾β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从凡纳滨对虾肌肉组织中克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,克隆序列连接到pBAD/gⅢA质粒,转化人大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,进行温度诱导表达重组蛋白.结果:克隆序列长度为1300bp,测序结果与Gene-Bank序列同源性达99.91%;获得重组体诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在约48kD处有表达的蛋白带,表达产物经Western Blotting鉴定为阳性.结论:获得β-actin基因在大肠杆菌中稳定表达产物.     

硫化物胁迫对凡纳滨对虾血细胞抗氧化酶基因表达的影响

硫化物是水产养殖过程中常见的水体污染物之一,为探讨抗氧化酶在凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei血细胞抗硫化物胁迫中的作用,以不同浓度(0 mg·L~(-1)和2.0 mg·L~(-1))的硫化物对凡纳滨对虾进行胁迫,于胁迫后的0 h、6 h、12 h、24 h和48 h取血淋巴,测定血细胞中铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白(TRx)基因表达量的变化。结果显示,Cu,Zn-SOD和TRx的表达量在胁迫的6~24 h显著上升,在48 h时恢复至对照组水平;Mn-SOD和GPx的表达量在胁迫的6~48 h均显著上调;CAT表达水平在胁迫的12 h开始有显著提高。这些结果表明凡纳滨对虾血细胞抗氧化相关基因的表达均被诱导上调,以进行防御;Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、GPx和TRx均对硫化物胁迫敏感,在胁迫前期发挥作用,CAT主要在胁迫后期发挥作用。