高效表达非融合蛋白的大肠杆菌质粒载体的构建

利用基因重组技术构建了高效表达非融合蛋白的大肠杆菌质粒载体pKPL系列。它们含有PL启动子、MS-2聚合酶SD顺序、起始密码、多克隆点及rrnB终止子顺序。利用pKPL-2D构建的PL-CAT-3质粒高效表达氯霉素转乙酰酶(Cat),表达量占菌体蛋白的30％以上。用pKPL质粒还表达出有生物活性的人白细胞介素-3和人粒单集落刺激因子。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆与表达

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５中扩增出长约１．４Ｋｂ的色氨酸酶基因,将其插入高表达载体ｐＥＴ３ａ的ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ位点,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）,构建高产色氨酸酶基因工程菌。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和薄层扫描表明,工程菌色氨酸酶的表达量占细胞总可溶性蛋白的６９．８％。酶活测定结果表明,７株工程菌色氨酸酶的活力比宿主菌均有不同程度的提高,其中ＷＷ－１１号比宿主菌高１６倍。     

单链抗体在大肠杆菌中的分泌型表达

单链抗体（scFv)是目前报道最多的一类小分子抗体，对科研及疾病的诊断和治疗有重要意义。本文介绍了scFv在大肠杆菌周质腔及培养基中分泌型表达的特点、影响因素及研究进展。     

在大肠杆菌中融合高效表达人MCP—1

目的：利用含强启动子的融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ对编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的基因进行高效表达。方法：基因重组技术及蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物占菌体蛋白的５０％。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测表明,表达产物可与抗ＭＣＰ－１抗体特异反应。     

α人心钠素基因在大肠杆菌两种表达载体系统中的高效表达

应用ＤＮＡ重组技术，将α人心钠素基因克隆到表达性质粒ＰＬＳＤ１３和ＰＬＭＧ２中，与Ｐ１噬菌体的ｒｅｆ基因片段融合，并处于ＰＬ启动子的控制之下，通过温敏的ＣＩ８５７阻遏子基因加以调控。转化大肠杆菌后，用４２℃升温诱导，使α－ｈＡＮＰ基因以融合蛋白的形成获得高效表达，产生的融合蛋白分别约占细胞可溶性蛋白总量的３５％和４８％。经一系列纯化步骤得到的α－ｈＡＮＰ２８肽样品具有明显的舒张血管和降低血压的作用     

肝肾微粒体1型抗原在大肠杆菌中的表达

肝肾微粒体１型抗原在大肠杆菌中的表达王达仲人前马筠孔宪涛肝肾微粒体１型抗原（ＬＫＭ－１）被看作是自身免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｓ，ＡＩＨ）中的一种重要的自身抗原。已知它为位于肝细胞微粒体中的细胞色素Ｐ４５０的ⅡＤ６组分（ＣＹＰⅡＤ...     

人醛缩酶A在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 用基因工程生产人醛缩酶A(ALDOA),为后续酶学研究奠定基础。方法 用Snapgene设计一对5′分别附加Nde I和Xho I位点的引物,PCR扩增ALDOA cDNA,cDNA与质粒pET-28a经Nde I+Xho I酶切后用琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA连接酶连接cDNA和pET-28a,连接产物转化大肠杆菌Top10,于卡那霉素的LB平板(LBK板)筛选抗性菌落。于LBK培养基培养抗性菌落,抽提质粒,酶切和测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选抗性菌落,于LBK培养基培养抗性菌落,0.2mmol/LIPTG,16℃诱导24h。超声破碎细胞,离心取上清,用Ni²⁺-NTA试剂盒纯化ALDOA。超滤浓缩纯化的ALDOA,用pH7.0磷酸缓冲液交换洗脱液,降低ALDOA溶液中的咪唑浓度。BCA法测定重组ALDOA浓度并保存。结果 大肠杆菌表达质粒pET-28a-ALDOA构建成功,重组菌pET-28a-ALDOA-BL21(DE3)经0.2mmol/LIPTG诱导后,ALDOA获得可溶性表达,产量达600mg/L。结论 ...     

EB病毒特异性DNA酶基因在大肠杆菌中的高效表达

含ＥＢ病毒特异性ＤＮＡ酶基因片段的大肠杆蓖受变温诱导后，其上清液在十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳时出现一条浓集带，分子质量大约为５２ｋｕ，符合ＥＢ病毒ＤＮＡ酶全基因编码蛋白质大小。     

重组褐藻胶裂解酶表达体系的构建及诱导条件优化

目的对褐藻胶裂解酶基因aly-cob进行外源表达,并优化诱导条件以实现褐藻胶裂解酶的高效表达。方法以产褐藻胶裂解酶菌株Cobetia sp.WG-007为出发菌株,对克隆得到的褐藻胶裂解酶基因进行稀有密码子改造,构建重组质粒pET-28a(+)-aly-cob,在宿主Escherichia coli BL21pLysS中进行诱导表达,对发酵培养基、异丙基 -D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度、诱导时机、诱导浓度及诱导时间进行系统优化以提高酶活。结果构建了重组菌E.coli BL21pLysS/pET-28a(+)?aly-cob,最适培养基为SB培养基,最佳诱导条件为OD600为1.0时加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG,在22℃下诱导24h后酶活可达2 403.93U/mL。结论成功对优化后的褐藻胶裂解酶基因aly-cob进行外源表达,经诱导表达条件优化后酶活为野生菌酶活的15倍,更具有工业化应用的潜力。     

脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆表达及酶活力测定

目的:在大肠杆菌中高效表达脱氢奎尼酸合成酶。方法:以大肠杆菌基因组为模板,采用PCR扩增得到脱氢奎尼酸合成酶基因aroB,并在大肠杆菌中进行表达。结果:在浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后aroB基因表达量占菌体总可溶性蛋白40.0%,SDS-PAGE显示重组菌诱导后表达的脱氢奎尼酸合成酶蛋白分子量约为38 kDa,发酵液中脱氢奎尼酸合成酶的酶活力达到178 U/L,为宿主菌的35.6倍。结论:脱氢奎尼酸合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达。     

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以E.coli MC4100染色体DNA为模板使用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC，该基因全长1044bp，编码相对分子质量为37ku的蛋白质。将该基因直接克隆于PET—16b质粒的T7启动于下游，得到质粒pEXP1。转化E．coli BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80-85倍。     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

食管癌相关基因2原核表达质粒的构建与诱导表达

目的：构建食管癌相关基因2（ECRG2）原核表达质粒，在大肠杆菌（E．coli）中诱导表达重组蛋白。方法：用聚合酶链反应法扩增ECRG2基因开放阅读框（ORF），构建表达载体pGDX-4T-1-ECRG2，测序鉴定后转化E．coli（BL21）进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，目的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、Western免疫印迹鉴定。结果：SDS-PAGE测定GSr／ECRG2蛋白分子质量约34ku，Western blot验证出目的蛋白特异表达。结论：ECRG2ORF插入pGEX-4T-1质粒并在E．coli中成功表达。     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

ChrA基因在大肠杆菌中的表达及其抗铬特性

目的 研究铬(Ⅵ)转运蛋白编码基因ChrA工程菌的抗铬(Ⅵ)能力及铬(Ⅵ)抗性机制.方法 以沙雷氏菌S2基因组作为模板,PCR扩增ChrA基因,连接表达载体pET-28a(+),转化至E.coli BL21表达.测定ChrA工程菌的Cr(Ⅵ)抗性、摄取能力和外排Cr(Ⅵ)能力,探索铬(Ⅵ)负载时间、含氧阴离子(硫酸盐、钼酸盐、钒酸盐、钨酸盐)和呼吸抑制剂(缬氨霉素、寡霉素、CN-、NADH)对其抗Cr(Ⅵ)能力的影响,分析ChrA蛋白转运Cr(Ⅵ)的机制路径.结果 成功构建pET-28a(+)-ChrA工程菌,并表达出膜蛋白ChrA;ChrA工程菌的Cr(Ⅵ)吸收能力低于对照株(P<0.05),Cr(Ⅵ)外排能力高于对照株(P<0.05);工程菌在50 mg/L Cr2O72-中负载30 min,新鲜溶液中释放10 min后,菌体中的Cr(Ⅵ)外排量达到20%,但随着铬(Ⅵ)负载时间延长,外排量逐渐减少;工程菌外排能力受含氧阴离子硫酸盐和钼酸盐显著抑制(P<0.05),推测ChrA蛋白是通过硫酸盐通道运输Cr(Ⅵ),而钨酸盐和钒酸盐对其Cr(Ⅵ)外排无明显抑制或促进作用;在抑制剂类别中,K+载体缬氨霉素、CN-显著性抑制其Cr(Ⅵ)外排,NADH促进其Cr(Ⅵ)外排(P<0.05),而寡霉素无明显抑制或促进作用,表明ChrA蛋白外排铬(Ⅵ)是利用质子动力通过细胞膜化学渗透作用把铬离子泵出细胞外.结论 ChrA蛋白具有将Cr(Ⅵ)从胞浆转运至胞外的作用,ChrA的表达提高了大肠杆菌的铬(Ⅵ)抗性能力.     

大肠杆菌yigP基因启动子的定位

在已知大肠杆菌yigP基因的最小功能片段为yigPP4P2基础上,将该片段装载于无外源启动子的载体质粒上,通过功能回补yigP基因缺陷株JDP14,发现其可以代替温敏质粒,保证大肠杆菌正常生长,推断其包含完整转录单元。RTPCR结果显示该片段内部有转录产物,即yigPP4P2片段具有转录独立性。将不同长度的yigPP4P2亚片段克隆到启动子探针质粒pSPZ上,通过对重组菌进行蓝白斑筛选及β半乳糖苷酶活性测定,结果显示pP40V3Z/JM83和pP40V4Z/JM83可观测到蓝色菌斑,并检测到较弱的β半乳糖苷酶活性,由此表明大肠杆菌yigP基因启动子位于该片段上游,下游边界位于引物V4区域内。