地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及原核表达

地衣芽孢杆菌(Bacillus Lichenifarmis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株．本实验在提取地衣芽孢杆菌完整的基因组DNA序列的基础上，通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的结构基因全长1449bp，与pUCm-T载体连接转化入宿主菌DH5α中，经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌，再提取质粒与表达载体pET-28a( )酶切后连接转化入宿主菌DE3中，其阳性克隆在37℃1．0mmol/L IPTG诱导下，α-淀粉酶的基因得到了较好的表达．表达产物经SDS—PAGE鉴定，确定表达的蛋白大小为58000 Dal左右，与理论推导的分子量相一致；并初步对酶及活性及酶活最适温度和pH进行了研究。     

地衣芽孢杆菌营养要求的研究

本文报道了地衣芽孢杆菌的营养要求,结果表明,以葡萄糖为碳源,多种氨基酸为氮源,地衣芽孢杆菌的最佳C/N为4～4．51。满足该菌对维生素H和必须氨基酸的需要以及主要无机盐的需要时,其菌数最高为(3．55～6．7)×107/ml,可使菌数是对照的2．1～3．5倍。     

基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立

根据6株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的gyrB基因序列设计了1对特异性引物F1和R1,扩增产物大小为303 bp,以此引物对为基础,成功建立了灵敏度为1×10-3mg·L-1(约为200个细菌/反应)的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法 .该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,它为今后从微生物群落结构复杂的环境中分离地衣芽孢杆菌奠定了良好的基础.     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的热稳定性研究

本文研究了环境因子对液体碱性蛋白酶２７０９＾＃热稳定性的影响，多种氨基酸、低浓度的各种离子以及羟基化合物等均能提高２７０９＾＃的热稳定性，氨基酸中以丝氨酸效果最好，Ｃａ＾２＋能极大的提高酶热稳定性，多糖类对酶的热稳定性效果不明显，但与适量合用，可显著提高酶的热稳定性。     

源于地衣的苏云金芽孢杆菌分离及PCR-RFLP分析

以非维管植物地衣为分离材料,采用热处理加抗生素及醋酸钠的方法,经常规形态学鉴定,分离到6株苏云金芽孢杆菌.为了解其生物学特性,分别对这6株菌株进行生理生化测定和cry基因的PCR-RFLP检测,结果显示: 6个菌株均含有cry1、cry1I 、cry2基因,所有菌株均不含cry3、cry4、cry5、cry6、cry8、cry10、cry11基因.初步确定6株菌株中含有5种 cry1亚类基因(cry1Ad,cry1Ba,cry1Cb,cry1Da,cry1Ea),1种cry2亚类基因cry2Ac,2种cry1I基因亚类(cry1Ia1、cry1Ib1),其中有2个菌株的PCR-RFLP图谱均出现特异性片段,推测可能存在新基因.     

地衣芽孢杆菌基因文库的构建及分析

作为一种高效无毒、无二次污染以及能够生物降解的水处理剂,生物絮凝剂受到越来越多的关注.以一株具有强絮凝活性地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为实验菌,通过构建基因组文库,尝试筛选絮凝基因阳性克隆子.结果表明,该菌株基因文库构建成功,共得到2.1×103克隆子.随机挑取17个阳性克隆子进行DNA测序分析,发现一些相对保守蛋白及2个不具有明确功能的基因.该结果为进一步研究地衣芽孢杆菌全基因组结构功能及细菌絮凝基因奠定了基础.     

工程菌JM—109—pTrcHis2A—phyA表达植酸酶的研究

目的：将来源于黑曲霉的植酸酶基因重组于大肠杆菌表达载体pTrcHis2A中,导入大肠杆菌JM109中,构建工程菌JM－109－pTrcHis2A-phyA。方法：基因重组,以及克隆和外源基因诱导表达 技术。结果：该工程菌能够有效地表达真核植酸酶基因,并且添加诱导剂IPTG,能使植酸酶的表达量成倍提高。结论：该表达系统被用做研究黑曲霉植酸酶体外改良的工具。     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15 U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.     

杜邦嗜热菌脂肪酶在黑曲霉中的异源表达

该文将杜邦嗜热菌脂肪酶TDL2在黑曲霉系统中异源表达,并考察TDL2自带信号肽和pCAMBIA质粒信号肽对脂肪酶TDL2表达的影响.利用PCR和无缝克隆技术,将脂肪酶TDL2的编码序列与质粒pCAMBIA0380线性片段拼接,分别构建利用β-葡萄糖苷酶bgl2的信号肽的重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和利用TDL2信号肽序列的重组质粒pCAMBIA-TDL2-2.用根瘤农杆菌介导转化宿主细胞A. niger CICC 2213构建组成型黑曲霉工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-1和A. niger/pCAMBIA-TDL2-2,在发酵120 h后其发酵单位分别达到18.5 U·mL^-1和38.3 U·mL^-1,实现了脂肪酶TDL2在黑曲霉中的异源表达.SDS-PAGE分析和活力测定结果表明:利用脂肪酶TDL2信号肽的工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-2比利用bgl2信号肽的工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-1的表达量更大、发酵单位更高.     

Expression of Aspergillus niger 9891 Endoinulinase in Pichia pastoris

An endoinulinase gene from Aspergillus niger 9891 (CGMCC0991) has been expressed in Pichia pastoris GS115 using pPIC9 vector. The recombinant endoinulinase was highly expressed and the optimization of the expression in a 7 liter of fermentor has been investigated. In fermented broth, the concentration of protein secreted is 2.15 mg/ml. The activity of endoinulinase is 1501 U/ml with sucrose as substrate and 291 U/ml with inulin as substrate, 105 and 273 times higher than that from the original strain respectively.     

利用黑曲霉诱导法克隆高山红景天UGT3基因片段

利用真菌诱导法克隆高山红景天糖基转移酶（UDP-glucosyltransferase,UGTs）基因.结果表明：用浓度为40mgS/L黑曲霉诱导子处理愈伤组织4d和6d,糖基转移酶基因的mRNA丰度最高;克隆得到的基因cDNA片段长度为1366bp,与所选取的其他植物糖基转移酶一致性在50%以上,具有糖基转移酶家族典型的结构域.把该基因命名为UGT3,GenBank接受号为EU199079,为后续实验奠定基础.     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA的克隆和序列分析及其在大肠杆菌中的表达(英文)

以poly(A)~ mRNA为模板,噬菌体λgt 10 DNA为载体构建了黑曲霉3758的cDNA的文库。用编码黑曲霉葡萄糖淀粉酶329—418位氨基酸的DNA顺序(456bp)作探针从该文库中筛选葡萄糖淀粉酶cDNA。采用原位噬菌斑杂交法获得11个阳性噬菌斑,从其中6个噬菌体中提取DNA进行限制酶切分析和印迹法转移杂交试验,发现这些阳性噬菌体DNA含有不同大小的插入片段,它们都能与DNA探针杂交,表明已克隆了葡萄糖淀粉酶的cDNA。采用单酶切及交叉双酶切法制定了2.1kbcDNA的物理图并对2.1kb片段作了全序列分析。序列分析结果显示,克隆的2.1kb片段含5＇端非编码区,编码葡萄糖淀粉酶的结构基因及3＇端非编码区。克隆的cDNA片段转移至表达载体λgt11,感染大肠杆菌后,产生的噬菌斑转移硝酸纤维素滤膜后与~(125)I标记的抗葡萄糖淀粉酶抗体进行免疫反应,结果证明含2.1kbcDNA的λgt11表现葡萄糖淀粉酶阳性.2.1kb片段也曾转至质粒pPL2,转化大肠杆菌JF1125。细胞裂解物在SDS-PAGE电泳中可看到新的蛋白带。这些结果表明,克隆的黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA可以在大肠杆菌中表达。     

一株地衣芽孢杆菌脲酶生产的发酵优化和酶学性质

对中国南海海绵Halichondria regosa中分离得到脲酶产生菌Bacillus licheniformis B81进行脲酶生产的发酵条件优化;并对其脲酶特性进行测试。通过对基础培养基筛选后,对选定基础培养基进行了Plachett-Bunman重要因素筛选,最终选定的重要因素通过单因素实验得到了最终的培养基配方为:葡萄糖25 g/L,蛋白胨12.5 g/L,牛肉膏5 g/L,酵母粉6.5 g/L,KH2PO42 g/L,NaCl 1 g/L,尿素0.625%(W/V),Ni(NO3)20.006 25%(W/V),H2O 1 L。优化后,使得脲酶的产量提高到了原培养基的170%。菌株所产生的脲酶的最适反应pH为7.0,最适温度为40℃,Pb2+、Cu2+对脲酶活性具有抑制作用。