应用DiI标记的氧化低密度脂蛋白观察人单核细胞源性的树突状细胞成熟的研究

目的 探讨氧化修饰低密度脂蛋白(oxLDL)和低密度脂蛋白(LDL)对人单核细胞源的树突状细胞(DCs)免疫功能的影响.方法 从人外周血清中离心提取低密度脂蛋白,经氧化后,分别用DiI荧光标记.将人外周血分离的单核细胞加入包含rhGM-CSF(20 ng/ml)和rhIL-4(20 ng/ml)的培养基中培养,使其分化为DCs.以PBS作阴性对照,分别与50 μg/ml的标记好的oxLDL和LDL混合培养48 h后,动态观察DCs成熟过程中的形态学变化,流式细胞术检测DCs成熟表型(CDla,CD80,CD86,HLA-DR),混合T淋巴细胞反应检测DCs对淋巴细胞增殖的影响.结果 使用DiI标记的方法良好地显示了DCs摄取OxLDL的形态学变化.OxLDL可促进DCs成熟表型CD86,CDla的表达,T细胞增殖作用明显增强(P＜0.05).结论 DiI是适合DCs形态学研究的良好的荧光标记物.OxLDL可促进DCs成熟,并增加DCs的免疫活性.     

氧化修饰低密度脂蛋白促进人单核细胞源树突状细胞的成熟及活化

目的　探讨氧化修饰低密度脂蛋白 (oxidized lowdensitylipoprotein ,oxLDL)和低密度脂蛋白 (lowdensi tylipoprotein ,LDL)对人单核细胞源的树突状细胞 (monocytederiveddendriticcells,MDCs)免疫功能的影响。 方法　采用免疫磁珠法分离人外周血CD14 单核细胞 ,经含rhGM CSF(10 0ng/mL)和rhIL - 4 (2 0ng/mL)的Cell gro培养 ,使其分化为MDCs。分别以PBS和LPS(5 0 0 μg/mL)作阴性和阳性 (成熟 )对照 ,观察经5 0 μg/mL的oxLDL和LDL干预 4 8h后 ,流式细胞术检测MDCs表型 (CD1a、CD4 0、CD86、HLA DR) ,混合T淋巴细胞反应检测MDCs对淋巴细胞增殖的影响 ,FITC Dextran检测MDCs吞噬功能 ,ELISA检测细胞培养上清细胞因子 (IL -12、IL - 10和TNF α)浓度。结果　与PBS相比 ,5 0 μg/mLoxLDL干预的MDCs,不但可明显上调共刺激分子CD86的高表达 ,而且反映MDCs成熟程度的CD1a也表达增强 ,与此同时经oxLDL处理的MDCs吞噬作用却明显减弱 ,进一步的混合T淋巴细胞反应显示经过oxLDL刺激的MDCs促T细胞增殖作用明显增强 (P <0 .0 5 ) ;此外 ,oxLDL可明显促进MDC分泌细胞因子TNF α、IL - 10和IL - 12 (P <0 .0 5 ) ,但明显弱于LPS组 ,而LDL无此作用。结论　oxLDL在促进DCs成熟的同时 ,DCs激活T淋巴细胞的能力也明显增     

氧化修饰性脂蛋白对C57BL/6J小鼠骨髓源性树突状细胞迁移的影响

目的:探讨氧化修饰性脂蛋白对C57BL/6J小鼠骨髓源性树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BM-DCs)迁移的影响。方法:制备C57BL/6J小鼠骨髓细胞悬液,利用树突状细胞专用分离液和细胞粘附性差异去除杂细胞,用rmGM-CSF和rmIL-4使其分化为BMDCs。采用流式细胞术检测BMDCs CD86和MHCⅡ的表达率、免疫荧光技术检测BMDCs CD11c的表达率,以此来鉴定获得细胞为实验所需要的BMDCs。实验分为PBS阴性对照组、LDL组、ox-LDL组、HDL组、oxHDL组和LPS阳性对照组,采用动物实验和Transwell迁移系统分别观察各实验组中BMDCs在体内外的迁移能力。结果:获得的BMDCs CD86、MHCⅡ和CD11c的表达率明显升高,是实验所需的细胞;与相应的脂蛋白组相比,其氧化脂蛋白处理的BMDCs组有更多的细胞发生迁移。结论:氧化脂蛋白可促进C57BL/6J小鼠BMDCs发生迁移。     

昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞成熟的影响

目的：研究昆布多糖对OX-LDL诱导的单核细胞源性树突状细胞（DC）成熟的影响。方法：采用密度梯度离心法分离出正常人外周血单核细胞,经由含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF,20ng/mL）和重组人白介素4（rh IL-4,20ng/mL）的DC无血清培养基中培养,培养至第5天均加入OX-LDL（100μg/mL）。第6天将实验组分成三组,分别加入昆布多糖5μg/mL,2.5μg/mL,0.5μg/mL;对照组加入PBS。待DC与昆布多糖共同孵育24 h后,镜下观察DC形态变化,同时收集DC细胞采用流式细胞术检测DC表型（CD86,TLR2）的表达。结果：与PBS对照组相比较,实验组TLR2的表达明显上调（P〈0.05）;CD86的表达下调,各组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,与刺激因素昆布多糖存在剂量依赖。结论：昆布多糖干预培养后,外周血单核细胞源性DC的TLR2表达上调,CD86的表达下调,进而推测昆布多糖可以抑制DC的成熟。     

糖基化终产物对人单核细胞源树突状细胞VCAM-1表达的影响

目的:探讨糖基化终产物 (AGEs))对人单核细胞源树突状细胞(DCs)血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响?方法:用免疫磁珠分离人外周血CD14+单核细胞,经含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 100 μg/L和重组人白细胞介素-4(rhIL-4) 20 μg/L的RPMI1640培养,使其分化为DCs,加入糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA) 200 μg/ml,采用RT-PCR和Western blot法,观察AGE-HSA对DCs VCAM-1 mRNA和蛋白表达的影响,同时检测培养液上清中IL-12和IL-18的浓度?结果:与空白对照相比,AGE-HSA可上调DCs VCAM-1 mRNA和蛋白的表达(P < 0.05),并且明显促进了DCs IL-12和IL-18的分泌(P < 0.05)?AGE-HSA干预组与空白对照组相比差异无统计学意义(P > 0.05)?结论:AGEs能够上调DCs VCAM-1的表达,并且促进DCs IL-12和IL-18的分泌,这可能是糖尿病通过DCs促进动脉粥样硬化发生的重要机制之一?     

普伐他汀对人单核细胞源树突状细胞免疫功能的影响

目的　探讨普伐他汀对在免疫调控中起重要作用的人单核细胞源树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法　采用免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含重组粒细胞巨噬细胞刺激因子(100 ng/ml)和重组白介素(rhIL) 4(20 ng/ml)的Cellgro培养,使其分化为DC。DC与50~100μmol/L普伐他汀孵育72 h后,采用流式细胞术检测DC表型(CD1a、CD40、CD86、HLA DR),混合T淋巴细胞反应检测DC对淋巴细胞增殖的影响,采用酶联免疫吸附试验法检测细胞培养上清液中Th1/Th2 [白介素(IL)- 12、干扰素(IFN) γ/ IL- 2、IL- 10]细胞因子的浓度。结果　与对照组相比,经普伐他汀处理的DC可下调CD80、CD86、HLA DR和CD1a的表达,对T淋巴细胞增殖作用明显减弱,明显抑制DC- Th1 细胞因子IL -12 和IFN -γ的分泌(P<0.05),但对Th2细胞因子IL -2 和IL -10水平无明显影响。100μmol/L甲羟戊酸可逆转普伐他汀的作用。结论　普伐他汀可明显抑制DC的成熟和免疫活性,此作用与甲羟戊酸途径有关。这可能是他汀类药物免疫调节的新机制。     

罗格列酮抑制糖基化-人白蛋白诱导的人单核细胞源树突状细胞的免疫成熟

目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂罗格列酮(rosiglitazone)对糖基化终产物(AGEs)诱导的人单核细胞源树突状细胞(DC)的免疫成熟的影响.方法:采用免疫磁珠法分离人外周血CDl4 单核细胞,经含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,100μg/L)和重组人白细胞介素4(IL-4,20μg/L)的RPMIl640培养5天,使其分化为未成熟DC.先经罗格列酮(50μmol/L)干预24h后,加入糖基化.人血清白蛋白(AGE-HSA,200μg/ml)再干预48h,采用流式细胞术检测树突状细胞表型(CD1a、CD80、CD86和HIA-DR),混合T淋巴细胞反应检测DC对淋巴细胞增殖的影响,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子a(TNF-α)和γ干扰素(INF-γ)的浓度.结果:与对照组相比,经罗格列酮处理的DC可明显下调由AGE-HSA促进的CD80、CD86、HLA-DR和CD1a的表达.使AGE-HSA促进的对T淋巴细胞的增殖作用明显减弱,明显抑制DC细胞因子IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的分泌(P<0.05).结论:过氧化物酶体增殖物激活型受体γ激动剂罗格列酮可以抑制糖基化-人血清白蛋白诱导的树突状细胞的免疫成熟及其免疫功能,这可能是它抗炎的重要机制之一.     

培养人动脉平滑肌细胞诱发高密度脂蛋白的氧化修饰

目的：观察高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）经与培养人动脉平滑肌细胞（Smooth muscle cell,SMC）保温后发生氧化修饰。方法：HDL组分琼脂糖凝胶脂蛋白电泳，及其共轭二烯（Conjugated diene CD)、硫代巴比妥酸反应物质（Thiobarbituric acid reaction substance TBARS）及脂氢过氧化物（Lipid hydroperoxide LOOH）的测定。结果：HDL经过与人动脉SMC共培养后，与天然HDL（Native HDL N-HDL)比较，其电泳迁移率明显增加，其CD、TBARS及LOOH的含量均显著增加（P＜0．01）。结论：HDL经过与培养人动脉SMC37℃保温48h后可发生氧化修饰。     

人外周血单核细胞体外诱导成熟和激活的树突状细胞

目的建立人外周血单核细胞体外培养成熟和激活的树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法。方法从健康成人外周血分离单核细胞(PBM),加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)1000U/mL、重组白细胞介素-4(IL-4)500 U/mL、体外培养7天后,加入或不加入肿瘤坏死因子(TNF-a)100ng/mL,流式细胞仪测定DC的主要组织相溶性复合体(MHC)-II类分子和协同刺激分子,分析其成熟度和激活度。结果PBM经GM-CSF和IL-4诱导培养7天后,细胞成簇,表型为CD8320.6%、CD8655%、CD11c 36.1%、CD643.2%、人类白细胞抗原(HLA)-DR 12.4%;加入TNF-a诱导2天后,细胞表型为CD8380.5%、CD8698%、CD11c 97%、CD643.4%、人类白细胞抗原(HLA)-DR 86%。结论GM-CSF和IL-4诱导培养PBM 7天,可获得大量不成熟DC,该体系有利于DC扩增,加入TNF-a继续培养2天后,DC成熟度高,激活性好,适合肿瘤免疫治疗。     

辛伐他汀对人单核源树突状细胞成熟及免疫功能影响的研究

目的：探讨辛伐他汀对人单核源树突状细胞（Dendriticcell，DC）成熟和免疫功能的影响．方法：梯度离心法分离人外周血单核细胞（peripheralblood monoucleav cells，PBMC），经含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（recombinanthumangranulocyte—macrophagecolony—stimulatingfactor，rhGM—CSF）和重组人白介素-4（recomlfinanthumaninterleukin-4，rhIL-4）的Cellgro培养，使其分化为Dc。以PBS组作阴性对照，LPS组作阳性对照，将Dc与Dil染料标记的氧化低密度脂蛋白共同孵育48h及Dc与100μmol／L辛伐他汀和50mg/LDiI染料标记的氧化低密度脂蛋白（oxy—LowDensityLipoprotein，Ox—LDI。）共同孵育48h作实验组，流式细胞术（FluorescenceActivatedCellSorting，FACS）检测DC表型（CDla、CD80、CD86、HLA—DR）的表达，同时镜下观察DC吞噬Ox—LDL的形态变化。结果：经辛伐他汀处理的DC可下调CDla、HLA—DR的表达，抑制DC对Ox—LDI．的吞噬作用。结论：辛伐他汀可明显抑制Dc的免疫活性，他汀类药物可能具有免疫调节的新机制。     

Ox-LDL诱导血管内皮细胞表达LOX-1

[目的]探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)作为氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的特异性受体在摄取ox-LDL后对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达LOX-1的影响以及LOX-1在ox-LDL诱导其自身表达中所起的作用.[方法]用天然低密度脂蛋白(n-LDL)、LOX-1的受体阻断剂聚肌苷酸[poly(I)]250μg/mL和爱兰苔胶(carrageenan)以及不同质量浓度的ox-LDL(0,10,20,50,100 μg/mL)与HUVECs作用于不同的时间(0,6,12,24,36 h),用Realtime RT-PCR测定LOX-1 mRNA的表达水平,用Western blot测定LOX-1蛋白表达水平,并比较加入LOX-1阻断剂前后LOX-1表达的变化.[结果]在HUVECs中加入不同质量浓度的ox-LDL(0,10,20,50,100μg/mL),各组剂量的ox-LDL都可以增加LOX-1 mRNA和蛋白的表达(P＜0.01),在10～50 μg/mL的剂量范围内有明显的剂量-效应关系.但n-LDL对LOX-1的表达无影响.随着ox-LDL与HUVECs作用时间的延长,LOX-1 mRNA和蛋白的表达显著升高(P＜0.01),在6～24 h内呈明显的时间-效应关系(P＜0.01).HUVECs预先与250 μg/mL的poly(I)或carrageenan作用2 h,然后再加入50 μg/mL的ox-LDL作用24 h.poly(I)和carrageenan都可以显著抑制ox-LDL诱导的LOX-1 mRNA和蛋白的表达(P＜0.01).[结论]Ox-LDL可以诱导HUVECs LOX-1的表达,该诱导作用可被LOX-1的阻断剂部分拮抗.表明LOX-1不仅特异性地结合ox-LDL,而且介导ox-LDL对LOX-1表达的上调作用.     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖及IL18分泌的影响

目的探讨氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖及白介素18（IL18）分泌的影响，以阐明其在动脉粥样硬化发生中的作用。方法体外培养人脐静脉内皮细胞株，3～6代用于实验。实验分空白对照组和不同浓度ox-LDL组。将不同浓度的ox-LDL（10、20、50、100、200mg／L）与内皮细胞共同孵育12、24、36、48h。采用细胞酶联免疫吸附分析（ELISA）检测培养上清液中IL18含量；采用四唑盐比色法检测各孔的吸光值（0D），以评价增殖效果。结果10mg／L ox-LDL促进内皮细胞增殖，20～200mg／Lox-LDL呈剂量依赖性抑制内皮细胞增殖（P〈0．05，P〈0.01）。正常内皮细胞不分泌IL18。ox-LDL诱导HUVECs分泌IL18，呈浓度依赖性，100mg／L浓度时IL18分泌达高峰。ox-LDL诱导HUVECs分泌IL18亦呈时间依赖性，与12h比较，24、36、48h均有统计学意义（P〈0.05，P〈0.01）。结论ox-LDL诱导HUVECs分泌IL18，抑制HUVECs增殖，这可能与ox-LDL致动脉粥样硬化作用机制有关。     

天然及氧化修饰高密度脂蛋白对内皮细胞部分分泌功能的影响

目的 研究天然高密度脂蛋白（N-HDL）及氧化修饰高密度脂蛋白（OX-HDL）对培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）部分分泌功能的影响。方法 采用培养人脐静脉内皮细胞,以0．01mol／L PBS为空白对照,以N-HDL为正常对照,分别加入不同质量浓度OX-HDL（5mg／L,10mg／L,50mg／L）共同孵育24h后,观察培养基中内皮细胞分泌一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、组织型纤溶酶原激活物（tPA）和纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）水平的变化。结果 和空白对照相比,N-HDL组NO的量（P＜0．05）和NOS活性（P＜0．01）明显升高,tPA和PAI-1的差异没有统计学意义（P均＞0．05）;OX-HDL组NO的量和NOS活性均显著下降,并呈剂量依赖关系,PAI-1活性也显著升高（P＜0．05）,tPA的水平差异无统计学意义。结论 N-HDL可以明显提高培养人脐静脉内皮细胞分泌NO的量并提高NOS活性,对tPA和PAI-1的产生则没有显著影响;而OX-HDL明显抑制内皮细胞NO合成和NOS活性,它不影响tPA的水平,却增加内皮细胞PAI-1活性。     

巨噬细胞ABCA1对Ox-LDL诱导的炎症因子的调节及其意义

 【目的】研究在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导作用下,ATP结合盒转运子A1(ABCA1)对巨噬细胞中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞化学趋向蛋白-1(MCP-1)mRNA和蛋白质及白介素-1β(IL-1β)蛋白质表达的影响,在细胞水平证实ABCA1对动脉粥样硬化的影响。【方法】用氟波酯(PMA)刺激THP-1细胞使之转变为巨噬细胞,Ox-LDL(30μg/mL)刺激3、6、12、24h后,以荧光定量RT-PCR和Western蛋白印迹法及酶联免疫吸附法(ELISA)检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1及IL-1β mRNA和蛋白质表达量;用反义寡核苷酸(100nmol/L)抑制ABCA1的表达,观察Ox-LDL刺激下上述指标的改变。【结果】给予Ox-LDL刺激后,巨噬细胞ABCA1、ICAM-1、MCP-1的mRNA和蛋白及IL-1β蛋白质表达均增高;给予反义寡核苷酸转染后Ox-LDL刺激3、6h,上述指标的mRNA表达降低(P<0.01),12、24h蛋白质表达降低(P<0.01)。【结论】在巨噬细胞,ABCA1可增加Ox-LDL诱导的炎症因子表达,参与动脉粥样硬化的发生。     

高脂饮食对兔血脂及氧化修饰低密度脂蛋白的影响

目的：研究高脂饮食对血浆中TG、TC、HDL-C、LDL-C及oxLDL的影响。方法：选用健康雄性新西兰纯种大耳白兔20只,随机分为对照组和实验组,对照组喂饲基础颗粒兔饲料,实验组喂高脂饲料。40天后抽血测定各项生化指标。结果：实验组Th、TC、LDL-C、oxLDL、MDA均高于对照组,而HDL—C、SOD低于对照组,两组比较均有显著差异。结论：高脂饮食可促进LDL的氧化修饰及脂质过氧化反应。     

Morphological Changes of Aorta and Total Cholesterol, High Density Lipoprotein, Oxidized Low Density Lipoprotein, Nitric Monoxide and Lipide Peroxidation in Serum after Arcuate Nucleus Lesioned

After arcuate nucleus of hypothalamus lesioned with monosodium glutamate and cutting infundibulum, morphological changes of aorta and total cholesterol, high density lipoprotein, oxidized low density lipoprotein, nitric monoxide and lipid peroxidation in serum were investigated to explore the effect of hypothalamic arcuate nucleus on the development of atherosclerosis. In experimental group of arcuate nucleus lesioned, degeneration of endothelial cells and edematous nuclei of endothelial can be observed, vesicles of various sizes in subendothelial tissue and smooth muscle cells migrated from tunica media to tunica intima through ruptured elastic interna, and the levels of total cholesterol, oxidized low density lipoprotein and lipid peroxidation in serum was significant higher and nitric monoxide was lower than that of control subjects. After cutting infundibulum, degeneration of endothelial cells with edematous nucleus and proliferous collagenous fibers around ruptured myo-endothelial junction were also observed. The structure of control group remained intact. Results suggest that hypothalamic arcuate nucleus might be of significance regulative effect in the development of atherosclerosis.     

丙丁酚抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖

本实验采用噻唑蓝（MTT）比色法观察氧化型低密度脂蛋白（OLDL）对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞增殖的影响及抗氧化剂丙丁酚的作用。结果表明OLDL能降低一氧化氮（NO）含量和刺激血管平滑肌细胞（SMC）增殖（P＜0．05），丙丁酚能拮抗OLDL刺激SMC增殖作用，同时增加NO含量。NO合成酶抑制剂硝基-L-精氨酸增强OLDL刺激血管平滑肌细胞增殖作用，且部分抵消丙丁酚的桔抗作用。提示丙丁酚能抑制OLDL刺激血管平滑肌细胞增殖作用，且与其促进平滑肌细胞合成释放一氧化氮有关。     

天然和氧化极低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的 探讨天然和氧化极低密度脂蛋白(n-VLDL，ox-VLDL)对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达血管细胞粘附分子1(VCAM-1)的影响。方法 将n-VLDL和ox-VLDL作用于培养的HUVEC，用细胞酶联免疫吸附试验(cell ELISA)和单核细胞粘附试验检测VCAM-1蛋白在HUVEC的表达，用原位分子杂交检测VCAM-1 mRNA的表达。结果 正常培养的HUVEC表达VCAM-1，n-VLDL和ox-VLDL促进HUVEC表达VCAM-1，尤以ox-VLDL作用更强。单核细胞粘附试验显示，n-VLDL和ox-VLDL促进单核细胞向HUVEC粘附。结论 天然和氧化极低密度脂蛋白可能通过增强血管内皮细胞表达VCAM-1而促进血液单核细胞粘附于血管壁，从而在动脉粥样硬化的早期病变中起重要作用。