基于报告基因的雌激素受体α亚型配体筛选模型的建立和应用

目的　建立基于报告基因的雌激素受体α亚型配体的筛选模型，用此模型对收集到的化合物进行筛选，以发现具有新结构的雌激素受体配体。方法　构建诱导性表达载体并转染入ERα ⁺HepG2细胞中，筛选报告基因CAT表达受雌二醇诱导的阳性克隆。采用ELISA法检测化合物对CAT表达的影响，体外细胞存活实验对化合物进行功能性检测。结果　ERα ⁺HepG2细胞中CAT的表达受雌二醇的诱导并呈现剂量依赖关系。化合物三羟基二苯乙烯诱导CAT表达的最大活性为雌二醇的1.75倍。结论　利用此模型通过测定CAT基因的诱导表达水平可筛选得到新结构的雌激素受体配体。     

人参皂苷Rb1抑制β淀粉样蛋白25-35诱导的皮层神经元tau蛋白过度磷酸化

目的探讨人参皂苷Rb1对凝聚态β-AP_25-35诱导的胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化的影响及其可能的作用机制。方法通过蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学染色法检测神经元tau蛋白磷酸化水平、总tau蛋白水平和糖原合成酶3β(GSK-3β)的蛋白表达水平。结果凝聚态β-AP_25-35(20 μmol·L^-1)作用于皮层神经元12 h，tau蛋白磷酸化水平和总tau蛋白水平均增高，同时GSK-3β蛋白表达也增多。用人参皂苷Rb1或GSK-3β特异性抑制剂氯化锂预处理后，凝聚态β-AP_25-35诱导的tau蛋白的过度磷酸化受到明显抑制，同时GSK-3β的表达也降低。结论人参皂苷Rb1可通过抑制GSK-3β的表达来抑制凝聚态β-AP_25-35诱导的皮层神经元tau蛋白的过度磷酸化。     

基于报告基因和NF-κB信号通路的抗阿尔茨海默病药物细胞筛选模型的建立与应用

目的建立基于报告基因和核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路的药物筛选模型,探讨不同化学结构类型的化合物对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的NF-κB信号通路的抑制作用。方法构建带有NF-κB靶序列和报告基因的诱导性表达载体(TATA-like promoter-NF-κB-secreted alkaline phosphatase,pTAL-NF-κB-SEAP),并将其转入人胚肾细胞(HEK293)中,考察模型的稳定性、时效、量效关系以及脂多糖对细胞的增殖作用。结果转染pTAL-NF-κB-SEAP的HEK293细胞中SEAP报告基因的表达受脂多糖的诱导并呈剂量与时间依赖关系,脂多糖对阳性克隆细胞无增殖作用,本模型的Z′因子为0.88。结论利用此模型通过测定分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)报告基因的诱导表达水平可筛选NF-κB信号通路抑制剂。     

基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

17β-雌二醇对人的类成骨细胞株TE85和U2功能的调节

目的：以人的类成骨细胞株TE85和U2为细胞模型，观察雌激素对细胞功能的影响。方法：³H-胸腺嘧啶参入法测细胞增殖；ELISA法测细胞因子IL-6含量；精氨酸转化法测iNOS活性。结果：IL-1(20 U.mL^-1)和TNFα(50 U.mL^-1)刺激细胞分泌IL-6，并抑制细胞增殖。在TE85细胞，17β-雌二醇(E₂)可抑制IL-6分泌并能对抗IL-1和TNFα对细胞增殖的影响。NOS抑制剂L-NMMA使细胞³H-胸腺嘧啶的参入降低，E₂(1 nmol.L^-1)可对抗L-NMMA的抑制作用。结论：E₂通过减少IL-6分泌和影响iNOS活性而调节细胞功能。     

E0703对雌激素受体(ER)不同亚型的选择性激活作用

目的探讨E0703(雌二醇衍生物)对雌激素受体不同亚型(α和β)的选择性激活作用。方法将报告基因质粒pTAL-SEAP-ERE和校正质粒pSV-β-gal共转染已稳定转染了雌激素受体α/β的人胚肾细胞(HEK293),加入E0703进行报告基因的诱导表达。采用EMSA试验观察E0703对ERα与雌激素反应元件(ERE)的结合增强作用。结果E0703对ERα具有较强的激活作用(最低激活浓度为10-8mol·L-1),激活强度略低于E2;E0703在10-10、10-9、10-8、10-7mol·L-1浓度下对ERβ没有激活作用;EMSA试验证明,E0703能够增强ERα与雌激素反应元件的结合增强作用。结论E0703对雌激素受体α具有选择性激活作用。     

人参皂苷Rb1通过JNK/p38 MAPK途径减轻Aβ25-35诱导的胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化

探讨在Aβ_25-35(beta-amyloid peptide (25-35)，Aβ_25-35)诱导的拟阿尔茨海默病样胎鼠皮层神经元tau蛋白过度磷酸化中，人参皂苷Rb1对tau蛋白磷酸化及JNK/p38 MAPK的可能作用。应用蛋白免疫印迹和免疫细胞化学染色的方法，观察tau蛋白磷酸化和JNK(c-jun N-terminal kinase)/p38 MAPK的表达情况。凝聚态Aβ_25-35(20 μmol·L^-1)作用于皮层神经元12 h，tau蛋白的磷酸化水平明显增高，同时JNK/p38 MAPK的总量及其活性形式——磷酸化JNK/p38 MAPK的蛋白表达水平也增加，人参皂苷Rb1可以减轻tau蛋白的磷酸化水平及JNK/p38 MAPK的蛋白水平。人参皂苷Rb1可通过JNK/p38 MAPK途径减轻Aβ_25-35诱导的tau蛋白过度磷酸化。     

药物生物利用度遗传神经网络预测研究

目的对药物生物利用度进行遗传神经网络预测。方法将人工神经网络与遗传算法应用于药物生物利用度预测研究，提出了采用遗传算法对人工神经网络进行优化的网络模型建立方法，利用遗传算法对神经网络模型中的权重进行优化,同时运用遗传算法强大的搜寻功能,得到特定条件下模型的最优解。并以药物分子体积(V)、分子折射率(R)、脂水分配系数(lgP_C)、水合能(H)、分子极化度(P)、前线轨道能量E_HOMO和E_HOMO为网络输入参数，以药物的平均生物利用度为网络输出参数，建立了药物生物利用度遗传神经网络预测模型。结果经遗传算法优化的GA-BP神经网络模型对生物利用度的预测精度为95.9%。结论该模型可以用于药物生物利用度预测研究。     

雌激素对Kv2.1钾电流及大鼠海马神经元延迟整流钾电流的影响

目的研究17β-雌二醇对Kv2.1钾电流和原代培养大鼠海马神经元延迟整流钾电流的作用。方法采用HEK293-Kv2.1细胞培养、大鼠海马神经元原代培养和膜片钳全细胞记录技术。结果17β-雌二醇浓度依赖地抑制Kv2.1钾电流和原代培养大鼠海马神经元延迟整流钾电流(I_K)。17β-雌二醇抑制Kv2.1钾电流和原代培养大鼠海马神经元延迟整流钾电流的IC₅₀分别为2.4和4.0 μmol·L^-1。通道动力学研究发现，17β-雌二醇(3 μmol·L^-1)显著左移Kv2.1钾电流的稳态激活和失活曲线，但只显著左移海马神经元延迟整流钾电流稳态激活曲线，而不影响该电流的稳态失活曲线。结论17β-雌二醇抑制Kv2.1钾电流与抑制I_K的程度相近，17β-雌二醇抑制I_K的作用可能部分通过阻断Kv2.1钾电流而实现。     

CYP1A1体外诱导活性评价模型的建立及其在人参皂苷筛选中的应用

目的 建立hAhR介导的CYP1A1体外诱导活性评价模型,应用于体外快速筛选通过hAhR途径介导的对CYP1A1具有激活能力的药物。方法 利用双荧光素酶报告基因系统,将CYP1A1启动子序列插入报告基因质粒上游,构建pGL4.17-CYP1A1质粒,并与含有hAhR编码区序列的pcDNA3.1-hAhR表达质粒瞬时共转染HepG2细胞, pGL4.17-control、pcDNA3.1（+）分别为pGL4.17-CYP1A1、pcDNA3.1-hAhR的空载体,建立hAhR-CYP1A1报告基因模型;应用AhR的完全激动剂TCDD（2 nmol/L）验证该报告基因模型的可靠性,应用该模型考察人参皂苷Rf、Rc、Re、Rg₁、Rb、Rd、Rh₂和Rg₃（20 μmol/L）通过hAhR途径对CYP1A1的诱导作用。结果 经验证,报告基因模型构建成功;人参皂苷Rf、Re、Rg₁和Rc对AhR具有激活作用,其中与对照组比较,人参皂苷Rg₁、Rc对AhR激活效应显著（P<0.05、0.01）,人参皂苷Rb、Rd、Rh₂和Rg₃对AhR无激活作用。结论 本研究建立基于hAhR的CYP1A1体外诱导活性评价模型,可为具有潜在CYP1A1诱导作用的目标化合物的筛选提供有效、快速的体外筛选手段,人参皂苷Rg₁、Rc对AhR-CYP1A1激活效应显著。     

慢性孵育β淀粉样肽25-35对培养大鼠海马神经元电压依赖性外向钾通道亚型mRNA表达的影响

目的研究慢性孵育β淀粉样肽_25-35(β-AP_25-35)对海马神经元电压依赖性外向钾通道亚型mRNA表达的影响。方法用RT-PCR方法检测mRNA的表达,用光密度扫描法半定量测定表达变化。结果在正常培养的海马神经元上延迟整流(Kv2.1,Kv1.5),瞬间外向(A型)(Kv4.2,Kv1.4),钙激活的大电导(rSlo)钾通道亚型均有表达。β-AP_25-35 3 μmol·L^-1孵育细胞24 h后,Kv2.1 mRNA的表达明显上调,其它亚型则无显著性变化;β-AP_25-35上调Kv2.1 mRNA的作用主要发生在β-AP_25-35应用后48 h内;60 h后Kv2.1 mRNA表达水平显著下调。结论Kv2.1转录水平的上调可能参与β-AP_25-35选择性地增加海马神经元上延迟整流钾电流(I_K)的作用。     

积雪草苷对小鼠胶原诱导性关节炎的抑制作用

研究积雪草苷(asiaticoside)对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)的作用，并初步探讨其作用机制。建立CIA模型，检测小鼠足爪炎症的肿胀度，石蜡切片HE染色对关节组织进行病理检查，MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应，Western blotting法检测关节软组织中环氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白的表达，EIA法测定关节软组织中前列腺素E₂(prostaglandin E₂，PGE₂)水平，ELISA法检测血清中炎症因子TNF-α、IL-6的水平。积雪草苷(10，20及40 mg·kg^-1)灌胃给药能剂量依赖性地减轻CIA小鼠的关节炎症状，抑制CIA小鼠C II胶原诱导的淋巴细胞增殖反应，减少CIA小鼠踝关节软组织中高水平的COX-2表达及PGE₂含量，降低血清中炎症因子TNF-α和IL-6的水平；同时病理检查发现，可以改善局部关节炎症状，抑制CIA小鼠滑膜细胞增生，减轻炎性细胞浸润。结果表明，积雪草苷对CIA具有抑制作用，其机制可能与抑制淋巴细胞增殖、减少COX-2表达及促进炎症因子TNF-α、IL-6释放等有关。     

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和干扰素 α(Interferon α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。方法　构建带有ISRE(IFN αstimulatedresponseelement)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞 (ECV304 )中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN α诱导的阳性克隆。选取相关的细胞因子干扰素 β、干扰素 γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察。结果　ECV304细胞中SEAP的表达受IFN α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN α的最高诱导表达率是IFN β最高诱导表达率的 9 0倍、IFN γ的 8 8倍、PTH的 9 1倍,具有相对特异性。IFN α对ECV304细胞无增殖作用。本方法的Z' 因子为 0 8,说明此模型具有很好的稳定性。结论　本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在 96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。     

1-(2,6-二甲氧基)-2-(3,4-二甲基苯乙氨基)丙烷盐酸盐(DDPH)拮抗α1肾上腺素受体的特性

目的　研究DDPH对α₁-肾上腺素受体(α₁-AR)及其亚型的拮抗作用。方法　放射配体结合实验和离体血管收缩功能实验。结果　DDPH对¹²⁵I-BE2254与大鼠脑皮质和脾脏α₁-AR结合呈竞争性拮抗作用。pK_I值在两者间无显著性差别, Hill系数均接近于1.0。在分别稳定表达α_1A,α_1B或α_1D-AR的克隆HEK293细胞中,其拮抗的pK_I值α_1A和α_1D比α_1B-AR高约2倍,Hill系数均接近于1.0。并拮抗去甲肾上腺素(NE)介导大鼠主动脉,肾动脉和脾脏收缩的pA₂值,在三者间无显著差别,斜率接近1.0。结论　DDPH对α₁-AR有竞争性拮抗作用,但其作用对α₁-AR亚型无选择性。     

二甲双胍改善去势大鼠胰岛素抵抗的机制研究

目的 探讨二甲双胍(MF)对去势雌性大鼠胰岛素抵抗的改善作用及机制。方法 采用放射免疫分析法RIA测定血清雌二醇(E₂)、孕酮(P)、胰岛素(INS)的水平,采用酶联免疫吸附试验ELISA测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平,采用逆转录聚合酶链反应RT-PCR测定胰岛细胞因子信号转导抑制因子-3(suppressor of cytokine sighting-3,SOCS-3)的基因表达。结果 与假手术(SHAM)组比较,去势(OVX)模型组E₂、P的含量显著降低,而TNF-α、INS含量则明显升高,同时大鼠胰岛SOCS-3基因表达明显上调(P<0.01)。与OVX组比较,去势二甲双胍低剂量(MF_低)组无显著影响,去势二甲双胍高剂量(MF_高)组E₂、P含量则显著升高(P<0.05),INS含量明显降低(P<0.05或P<0.01),大鼠胰岛SOCS-3基因表达明显下调(P<0.01)。结论 长期大剂量使用MF可以改善去势大鼠的胰岛素抵抗现象,其机制可能与下调TNF-α和胰岛SOCS-3基因表达有关。     

一种新的α1A肾上腺素受体选择性拮抗剂—Sertindole

本工作分别在稳定表达α_1A,α_1B和α_1D肾上腺素受体(adrenoceptor,AR)的人胚胎肾脏细胞( human embryonic kidney 293,HEK 293)和大鼠离体血管上,用放射配体结合实验和离体血管收缩功能实验方法以确定sertindole对α₁-AR亚型的选择性拮抗作用。结果显示sertindole与克隆α_1A-AR的亲和性分别是与克隆α_1B-AR和克隆α_1D-AR的69倍和132倍。Sertindole拮抗去甲肾上腺素引起的主动脉和肾动脉收缩反应的pA₂值分别与其对α_1D和α_1A亚型的pKI值相符。分别稳定表达3种亚型受体的HEK293细胞膜标本经与sertindole预温育30min后,受体与¹²⁵IBE2254结合的B_max值显著降低,KD值无显著变化;而在 sertindole 存在条件下,α₁-AR3种亚型与¹²⁵IBE2254 结合的KD值显著增大,但B_max值无显著改变。上述结果表明sertindole为不可逆性竞争性α₁-AR拮抗剂,并有α_1A亚型选择性。     

雌三醇11位取代物的合成

为了寻找新的雌激素类药物,合成了(11),(14a)～(14d)等五个雌三醇的11位取代物(11α-OH,11β-OH,11α-OCH₃,11β-OCH₃,11β-OAc)供药理筛选。化合物的制备采用了新的合成路线;对△⁹⁽¹¹⁾-雌酚酮缩酮物(3)及11位取代雌酚酮烯醇酯化合物(10a),(10b)的硼氢化反应进行了考察,分离得到了9α-羟基物(5)及11位取代的16表雌三醇(13a)、(13b)等副产物。所有化合物的结构均通过光谱解析和化学转换得以确证。     

知母中的两种新呋甾皂苷

目的研究知母根茎的化学成分。方法采用水煎提取、大孔吸附树脂SP825柱色谱、反相C₁₈柱色谱等进行分离，并通过化学手段和光谱分析(FAB-MS，¹H NMR，13C NMR，¹H-¹H COSY)鉴定其化学结构。结果从知母根茎中分离得到6种甾体皂苷，分别鉴定为：(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5β-呋甾-2β，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷N，1)，知母皂苷E_l(2)，(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-2β，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷O，3)，知母皂苷E₂(4)，(25R)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5α-呋甾-2α，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-［β-D-吡喃木糖基-(1→3)］-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷(purpureagitosid，5)，marcogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside (6)。结论化合物1和3为新化合物，命名为知母皂苷N和知母皂苷O，化合物5为首次从知母中分离得到。     

内皮素对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜钾通道的影响

目的观察内皮素(ET-1)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)膜电压门控钾通道(K_V)的作用。方法用全细胞膜片钳记录方法研究ET-1对膜电位(E_m)、膜电容(C_m)、电压门控钾电流(IK_V)的影响。结果ET-1可引起PASMCs去极化,并抑制IK_V,抑制IK_V时间明显早于其对E_m变化的影响,ET-1对IK_V的影响呈可逆性和浓度依赖性,在有钙的环境中,ET-1对IK_V峰电流的抑制率明显高于无钙时。结论ET-1可浓度依赖性的抑制IK_V,使常氧大鼠PASMCs去极化,且ET-1对IK_V的抑制作用早于对E_m的影响,这些作用不完全依赖于钙的参与,但钙可加强ET-1对IK_V的抑制作用。     

前列腺素E1经不同途径给药后的大鼠体内药效学比较

本文研究了前列腺素E₁(PGE₁)分别经不同途径给药后的大鼠体内药效学，旨在寻找目前PGE₁注射给药的替代途径。以PGE₁降压效应作为药效学指标，以静脉注射为对照，分别测定PGE₁经鼻腔、舌下、肌肉(im)、腹腔(ip)给药后的药效学参数，包括峰效应时间(Tmax)，血压下降最大百分数(Emax，%)，效应持续时间(T_d)以及血压下降百分数-时间曲线下面积(AUC，%·min)。研究结果表明，PGE₁经上述途径给药后，药效学参数Emax，T_d，AUC等均随给药剂量的增加而增大，提示存在明显的剂量-效应关系。根据所测Tmax值，推断上述给药途径其吸收速率的大小顺序为：鼻腔≈im>ip>舌下；依据所测药理生物利用度(PF)值，预测药物绝对生物利用度的顺序为：鼻腔>im≈ip>舌下。上述研究结果提示，PGE₁经鼻腔与舌下黏膜给药，有望替代目前的注射给药。