人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究

目的建立人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的方法,探讨该方法培养的脐带间充质干细胞特性及分化潜能。方法用新取的脐带制成细胞悬液,放入含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养,动态观察原代培养细胞的生长过程。取生长状态良好的第三代细胞(P3),MTT检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测表面标志物CD29、CD44、CD31、CD45、CD34,鉴定hUC-MSCs;诱导hUC-MSCs分化成为脂肪细胞,鉴定所分离的hUC-MSCs具有多向分化能力。结果来源于人脐带培养的MSCs呈现梭形生长,经流式细胞仪检测示CD29(98.3%)、CD44(99.2%)阳性,CD34(0.3%)、CD31(0.8%)、CD45(0.4%)阴性,经过诱导分化,证实hUC-MSCs有成脂分化潜能。结论采自脐带标本分离培养可获得稳定、均质性良好的hMSCs,并具有多向分化能力。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的优化研究

目的探讨使人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞诱导分化的高效诱导体系。方法按照不同浓度的地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C分将实验为4组,并设立空白对照组,诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化,应用碱性磷酸酶钙钴法染色检测分化的成骨细胞的成骨特性。结果在地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10-2mol/L、维生素C 3×10-4mol/L时,积分光密度值最高。结论 MSCs具备较强的增值能力和良好的成骨特性,可为骨缺损修复技术优化提供基础。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 明确大鼠骨髓间充质干细胞(bone mensenchymal stem cells,BMSCs)在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其向成骨细胞分化的能力,探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法.方法 提取大鼠原代BMSCs,用酠EM完全培养基和成骨诱导条件培养基体外培养,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态;台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线;ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和von Kossa染色检测细胞矿化结节,以判断细胞是否向成骨细胞分化.结果 全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长,呈梭形或多角形;使用Dex-SaMEM向成骨诱导后的BMSCs具有与成骨细胞在体外培养时相似的特征,倍增时间延长;合成ALP能力显著增强(P<0.05),von Kossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节.结论 全骨髓培养法取材方便,经成骨诱导培养的BMSCs表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性,该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的基础研究和临床应用广泛,BMSCs具有良好的成骨分化潜能,同时具有多向分化的能力,可向脂肪、骨、软骨细胞分化。BMSCs在合适的生长因子作用下可以快速地向成骨细胞分化和增殖,并且具有容易取材、容易分离、容易扩增、多谱系转化而不发生明显免疫排斥反应等优点,在骨组织工程领域拥有广泛的应用价值。但是,随着使用增多,存在的问题也日益突出,如生物学特性、分离鉴定、诱导分化和临床应用进展等问题还有待进一步解决。     

人脐带源间充质干细胞的培养及生物学性状

目的 建立从脐带分离培养间充质干细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 脐带经剪碎置于?MEM培养基中培养至细胞爬出,细胞生长达80%培养皿底后传代,整个过程用倒置显微镜观察细胞形态,绘制生长曲线,用免疫荧光方法测定细胞免疫表型并研究其冻存及复苏.结果 脐带组织经直接贴壁培养法可培养出成纤维样细胞,免疫表型分析CD44和CD20阳性,冻存复苏后细胞存活率在90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性.结论 脐带组织培养可获得大量间充质干细胞,为间充质干细胞应用于科学研究和临床治疗提供了新的细胞来源.     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性和超微结构

目的 分离和培养人脐带间充质干细胞(MSC),研究其生物学特性和超微结构.方法 提取人脐带MSC,测定其增殖、周期和凋亡情况,采用透射电镜观察细胞的超微结构,酶联免疫吸附测定法检测细胞分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)水平.结果 人脐带MSC为成纤维细胞样,增殖能力强,超微结构分析其细胞代谢活跃,迁移分化能力强,能分泌VEGF、IGF-1和HGF等细胞因子.结论 人脐带MSC能分泌多种抗凋亡因子,具有良好的生物学特性.     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及其在血液系统疾病中的应用

间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞,在组织工程、基因治疗和造血干细胞移植领域具有较好的应用前景。骨髓是间充质干细胞的经典来源。近年研究显示,人脐带中也存在大量间充质干细胞,由于脐带来源间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富以及免疫原性低等优点,正逐渐成为间充质干细胞研究领域的热点之一。本文就其生物学特征、优势以及在血液系统疾病中的应用前景等予以综述。     

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状

目的建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。方法脐带经酶消化后于DMEMLG/F12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFUF),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RTPCR检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,RTPCR检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。结果经酶消化后,每cm脐带可得到中位数为1.01×106的有核细胞,CFUF产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02±10.53)h。流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G0/G1期,S+G2+M期的细胞仅占(13.04±4.31)%。免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD166和MHCI阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和MHCⅡ阴性。体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RTPCR显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素3。与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。结论建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及其肝细胞生物学特性分析

目的：分离、培养人脐带基质来源的间充质干细胞（hUC-MSCs）,观察其部分肝细胞生物学特性。方法：利用组织块贴壁培养法从脐带基质中分离培养hUC-MSCs,观察细胞形态,采用细胞免疫荧光法检测表面标记物CD44,通过RT-PCR法检测肝细胞标志基因ALB、CK18、G6P、GLUL、MET、TAT的表达情况,并进行PAS糖原染色。结果：从脐带基质分离出成纤维样细胞形态的hUC-MSCs,CD44表达阳性;RT-PCR结果表明培养的hUC-MSCs表达成熟肝细胞的标志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET,而不表达TAT,PAS糖原染色呈阳性反应。结论：组织块贴壁培养法可有效获得稳定、均质性良好的hUC-MSCs,其具备部分肝细胞生物学特性。     

人脐带间充质干细胞分离培养建立及其生物学特性观察

目的:建立从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法,并探讨UC-MSCs的生物学特性。方法:分别采用原代贴壁培养法和酶消化法(胶原酶Ⅱ和胰酶)分离培养UC-MSCs,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术检测第3代以后的UC-MSCs表面特异标志物表达,MTT法检测P7细胞增殖情况。UC-MSCs同外周血单个核细胞共培养后,用MTT法测定细胞增殖率,Hoechst与PI双染色,观察UC-MSCs对健康人淋巴细胞增殖的影响。结果:原代贴壁培养法1周左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出,成簇生长;酶消化法3~5天可见成纤维样细胞均匀生长。传代培养后,UC-MSCs均呈长梭形、旋涡状生长;细胞核大,核仁清晰;免疫表型:CD29阳性率为(95.71±2.23)%,CD31和CD34阳性率分别为(2.47±0.54)%和(3.24±0.34)%;第7代UC-MSCs仍具有较强的分裂增殖能力。UC-MSCs对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性,而淋巴细胞对UC-MSCs的生长未见影响。结论:从人脐带中成功分离培养的细胞具有UC-MSCs生物学特性。     

低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)冻存前与复苏后的生物学特性,为规模化储备UC-MSCs提供试验支持。方法采用胶原酶消化法从脐带中分离UC-MSCs,贴壁培养传代,将第3代UC-MSCs利用程控降温仪冷冻,置于-196℃液氮中冻存6个月后复苏,比较冻存前和复苏后UC-MSCs的细胞形态、生长曲线、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性。结果复苏后UC-MSCs仍呈成纤维样形态生长,生长曲线与冻存前相似;免疫表型仍高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、CD154、HLA-DR;在特定的体外诱导条件下,仍可以向骨、脂肪、软骨分化。结论冻存复苏后UC-MSCs的生物学特性仍保持稳定。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养及向成骨细胞表型的诱导分化

目的观察兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养增殖的生长特征及体外诱导条件下的成骨能力情况.方法抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,经密度梯度离心分离出MSC,用塑料培养板贴壁培养进一步纯化MSC,并培养增殖.观察MSC的生长特征,测定其生长曲线及贴壁率.对第2代MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况.结果MSC为贴壁生长,以均一的梭形的成纤维细胞样生长,增殖能力强.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性明显提高,并且出现矿化结节.结论获得的兔骨髓MSC生长增殖旺盛,分离培养MSC是可行的,且MSC具成骨分化潜能.     

IGFBP7促进人脐带间充质干细胞的软骨分化

目的：探究胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin?like growth factor?binding protein 7,IGFBP7）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord?derived mesenchymal stem cells,hUC?MSCs）软骨分化的影响。方法：用软骨诱导培养基高密度成球培养hUC?MSCs,诱导成软骨分化,通过real?time PCR和Western blot检测软骨分化标志基因Sox9的表达,甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖的表达,以反映细胞外基质沉积情况;real?time PCR和Western blot检测IGFBP7在hUC?MSCs软骨分化过程中的表达情况;在hUC?MSCs中分别瞬时转染IGFBP7的表达质粒和siRNA以改变内源性IGFBP7表达水平,然后成软骨诱导,采用甲苯胺蓝染色,real?time PCR和Western blot检测IGFBP7表达变化对于hUC?MSCs成软骨分化的影响。结果：在hUC?MSCs成软骨分化过程中,IGFBP7 mRNA水平和蛋白水平表达均显著升高。与对照组相比,过表达IGFBP7的hUC?MSCs经成软骨诱导后,Sox9表达量显著升高,甲苯胺蓝染色更深,软骨分化能力更强。反之,敲低IGFBP7表达后,hUC?MSCs的软骨分化能力降低。结论：IGFBP7促进人脐带间充质干细胞成软骨分化。     

人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究

目的研究脐带间充质干细胞（UC-MSCs）在体外分离、培养、扩增和鉴定以及向神经元分化的方法.方法 30例符合入选标准的脐带采用贴壁法分离得到UC-MSCs,选用20%FBS血清培养液进行原代培养,再选用10%FBS扩增培养液进行一般传代.用神经分化培养基诱导UC-MSCs向神经细胞分化,在荧光显微镜下观察细胞形态,透射电镜观察UC-MSCs超微结构,用流式细胞仪分析其表面特性,采用直接和间接免疫荧光法检测细胞悬浮液的表型特征,用抗人神经纤维M、突触素、微管蛋白、半乳糖神经酰胺的单克隆抗体检测各代之间神经诱导形成率.结果 12 h后细胞开始贴壁生长,超微结构观察表现出未分化细胞的特征,CD123、CD49、CD29、CD73和CD166均为阳性,免疫荧光检测人UC-MSCs分化成神经细胞.结论 UC-MSCs长期传代培养,生物学特性稳定,具有向神经细胞分化的潜能.     

BHA诱导人脐带间充质干细胞分化为神经细胞

目的:探讨丁基羟基茴香醚(BHA)能否将人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)诱导分化为神经细胞.方法:正常培养的第4代hUC-MSCs利用200 μmol·L-1 BHA加2 mmol·L-1巯基乙醇(β-ME)进行诱导.每12 h观察细胞形态变化,并于诱导后24和72 h收集细胞,提取RNA,RT-PCR检测基因表达情况,于第3天进行免疫荧光染色.结果:诱导12 h后即有少量细胞发生形态变化,随着时间的推移变化越来越明显,72 h时绝大部分细胞都已变成神经细胞形态.免疫荧光染色nestin、GFAP及NSE阳性.RT-PCR检测诱导后24 h开始有nestin、MAP及NF-L表达,72 h后nestin和NF-L表达减少,MAP表达增强,同时NeuroD1也有较强表达,表明此时已分化为成熟的神经元细胞.结论:BHA能快速地将hUC-MSCs诱导分化为神经细胞.     

脐带组织间充质干细胞分离及向成骨与脂肪细胞的分化

目的探讨人脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞诱导分化的方法与条件。方法取脐带沿血管长轴切开,去掉血管,再将脐带重新缝合形成环状,灌入胶原酶悬液,6～8h后灌洗离心,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,取传代细胞进一步行免疫表型测定和成骨、成脂肪细胞诱导分化。结果去除血管后获取脐带组织细胞的方法,可获得贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形样细胞,易扩增和形成集落,有基质细胞免疫表型表达,成骨诱导分化的细胞茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,碱性磷酸酶钙钴法染色胞质呈灰黑色,阳性细胞百分率>85%;成脂肪分化的细胞油红染色示胞浆充满了油滴空泡。结论脐带组织存在具有间叶细胞分化能力的间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,传代细胞表达基质细胞表面抗原,能够向成骨细胞、成脂肪细胞分化。     

人脐带间充质干细胞多向分化能力的研究和应用进展

<正>人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesnchymalstem cells,HUCMSC)是存在于脐带沃顿胶(wharton's jelly)和血管周围组织中的一种非定向干细胞,是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的一种多能干细胞,并且可以保持其原始表型而无自发分化,具有有限寿命和干细胞的一般特性[1]。经研究人脐带间充质干细胞可     

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的：观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法：培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果：动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论：人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。