褐藻多糖硫酸酯的结构与生物活性研究

褐藻多糖硫酸酯（fucoidan,FPS）是所有褐藻中所固有的细胞间多糖,存在于细胞壁基质中。生长于潮间带、长时间与空气接触的褐藻种类中,如多年生的墨角藻（Fucus vesiculosus）类,其褐藻多糖硫酸酯的含量可高达20%;生长在较深处的海带（Saccharina japonica）类中含量较低,约为1%~2%。褐藻多糖硫酸酯是一类独特的结合有硫酸基的水溶性杂聚糖,其化学组成和结构非常复杂,以岩藻糖和硫酸基为主,随着褐藻的种类不同还含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。褐藻多糖硫酸酯具有多种生物活性,目前针对墨角藻、泡叶藻（Ascophyllum nodosum）、鼠尾藻（Sargassum thunbergii）等褐藻中的褐藻多糖硫酸酯研究较多,发现其具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化等生物活性。本文主要就褐藻多糖硫酸酯的提取、纯化、结构及生物活性等方面研究进行综述。     

转录组和蛋白组分析海带褐藻多糖硫酸酯对RAW 264.7细胞的免疫调节作用

海带(Saccharinajaponica)是我国的主要经济褐藻,从海带中制备的褐藻多糖硫酸酯具有免疫调节等多种生物活性,但鲜有基于组学的研究报道。本文采用RNA高通量测序(RNA-sequencing,RNA-seq)转录组学技术以及平行反应监测(ParallelReactionMonitoring,PRM)靶向定量蛋白组学方法,探究海带褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬细胞RAW 264.7后对巨噬细胞功能和通路的影响。结果表明,褐藻多糖硫酸酯(100μg/mL)作用于RAW 264.7细胞后,差异表达基因主要富集在免疫反应、先天性免疫应答等生物过程以及TNF、NF-κB、Toll样受体等信号通路,也可促进RAW 264.7细胞膜蛋白A类清道夫受体(SR-A)中SCARA3和Toll样受体中TLR4的表达。采用流式细胞仪对褐藻多糖硫酸酯作用后SR-A和TLR4的表达量进行蛋白水平的验证, SR-A和TLR4的表达量均有升高,证实了组学结果的可靠性。本研究结果为利用褐藻多糖硫酸酯开发具有免疫调节作用的功能食品或药物提供依据。     

褐藻多糖硫酸酯对脂多糖诱导大鼠肾小球系膜细胞NO产生量的影响

慢性肾衰的进程中伴随着肾脏炎症的发生,研究表明褐藻多糖硫酸酯具有抗炎作用,且对于慢性肾衰的早期治疗具有一定的作用。本文通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导,建立大鼠肾小球系膜细胞的炎症模型,用来源于海带的高分子质量褐藻多糖硫酸酯F1和低分子质量褐藻多糖硫酸酯F2对细胞进行处理,24 h后MTT法检测各组细胞活力,Griess法检测24 h及48 h后细胞培养液中NO的含量。结果表明,各组间细胞活力无明显差异;脂多糖可以诱导大鼠肾小球系膜细胞NO产量增加,F1和F2均可在一定程度上抑制脂多糖诱导的NO产量的增加,从而减轻细胞炎症反应。剂量为25μg/m L的F1和F2处理细胞48 h后,与模型组相比,F1和F2组细胞培养液中NO含量分别下降22.52%和38.65%,低分子质量褐藻多糖硫酸酯抗炎效果明显高于高分子质量褐藻多糖硫酸酯。     

毛细管气相色谱法测定海带提取多糖中的L-褐藻糖含量

建立快速而准确灵敏的方法测定海带(Laminaria japonica)提取多糖——褐藻多糖硫酸酯中的L,褐藻糖含量。海带多糖经酸解后,转化成糖腈乙酸酯衍生物。采用SGEAC225毛细管柱进行分离,实验中以肌醇为内标物。从青岛产海带提取的褐藻多糖硫酸酯中仅含有L,褐藻糖和I)-半乳糖2种单糖,样品10-1,10-2,10-3,1阻4中的L褐藻糖的平均含量分别为32．9072％,32．3147％,31．2924％,32．3571％,回收率为97．1％～99．9％,变异系数为0．23％～0．60％。采用气相色谱法测定海带多糖中的L褐藻糖含量准确、可靠。     

几种褐藻多糖硫酸酯的提取、成分分析及抗氧化活性研究

褐藻多糖硫酸酯是一种含有硫酸基的水溶性杂聚糖,其化学组成对抗氧化活性有较大的影响。本文对三种褐藻来源的褐藻多糖硫酸酯及其降解产物化学组成和抗氧化活性进行了研究,阐明了不同来源褐藻多糖硫酸酯体外抗氧化活性的构效关系。实验结果表明:1)分子量对抗氧化活性有较大影响,但是对不同褐藻来源的褐藻多糖硫酸酯的影响趋势并不一致。2)岩藻糖、硫酸基和糖醛酸含量对清除超氧阴离子自由基的影响与分子量有一定的关系。对于低分子量样品,岩藻糖和硫酸基含量与抗氧化活性成正相关。3)岩藻糖和硫酸根的比值对羟基自由基的清除能力有一定影响,比值越大,羟基自由基的清除能力越强。分子量、岩藻糖、硫酸基和糖醛酸的含量对褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性的影响依次减小。本研究为褐藻多糖硫酸酯在抗氧化剂保健品和功能食品中的应用提供了基础数据,也为裙带菜、羊栖菜和铜藻的高值化利用提供了理论依据。     

几种海藻多糖硫酸酯碱式铝盐的制备

本文以褐藻胶和κ-卡拉胶为原料通过酸水解分别获得了低聚的甘露糖醛酸、古罗糖醛酸和低聚 κ-卡拉胶 ,并采用 HPGPC法测定了这 3种低聚糖的重均分子量。在此基础上再经硫酸酯化和成盐修饰制备了各自的硫酸酯碱式铝盐。对制得的几种碱式铝盐进行了红外光谱 (IR)分析和有机硫含量 (S% )、铝含量 (Al% )及样品制酸力等部分理化性质的测定。测定结果初步显示出这几种海藻多糖硫酸酯碱式铝盐较好的抗消化性溃疡前景。     

褐藻多酚的结构单元及生成机理

在褐藻多酚研究中，传统的观战即间苯三酚是褐藻多酚的结构单元，在多酚结构规律方面不能地解释６种酚类分子的成因。作者在理论分析和综合前人实验结果的基础上，提出１，２，３，５－四羟基苯为褐藻多酚的结构单元，它在褐藻细胞中的存在形式为１，２，３，５－四羟基苯－２，５－二硫酸酯或１，２，３，５－四羟基苯－２－硫酸酯或并指出褐藻多酚可能的生成机理，初步为不同种类多酚分子的生成规律提供了一种统一的、清晰的解释。     

3种褐藻色素-蛋白复合物的分离及光谱特性

以非离子去污剂ＤＭＧ增溶３种褐藻的类囊体膜,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离色素－蛋白质复合物,并测定其光谱特性及表现分子量。结果表明,３种褐藻的电泳分离结果完全相同,都分离到６条含色素的蛋白质复合物。从不同褐藻类囊体膜上得到的同一种复合物的吸收光谱和荧光发射光谱特性一致,３种褐藻的ＰＳＩ复合物都有位于７１５ｎｍ处的长波荧光发射峰。电泳方法测得３种褐藻同一种以素－蛋白质复合物的表观分子量相近。     

HPLC法测定兔血清中海洋硫酸多糖聚甘古酯的浓度

建立了测定兔血清中硫酸多糖药物聚甘古酯的高效液相-柱后衍生荧光色谱方法。以盐酸胍为衍生试剂,采用离子排阻柱Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm),0.005mol.L-1H2SO4为流动相,流速为0.5mL.min-1,荧光检测,外标峰高法定量。方法线性范围为10~100μg.mL-1。高、中、低3种浓度的日内及日间精密度的RSD分别为4.28%,4.05%,5.97%,6.78%,5.32%,7.68%。高、中、低3种浓度的相对及绝对回收率平均值分别为92.32%,94.76%,94.44%,72.07%,73.42%,70.77%。本方法可准确、快速测定兔血清中聚甘古酯的浓度,为其药物动力学研究提供了1个灵敏、可靠的分析方法。     

褐藻多糖高产菌株的构建

Pseudomonas sp．QDA是从海水中发现的产生褐藻多糖的细菌,无致病性。为提高QDA菌株褐藻多糖的产量。本文利用PCR克隆了粘性菌株P．aeguginosa FRD1的atgT基因,连接入质粒pMF36-Kan,构建了重组表达载体pMF36-Kan-algT。利用三亲接合法将pMF36-Kan-algT转入菌株QDA中。糖醛酸含量测定结果表明,atgT基因过量表达菌株的褐藻多糖产量比出发菌株QDA平均提高了3．3倍,其中菌株A25提高了4．5倍。通过培养条件的进一步优化,A25菌株的褐藻多糖产量与菌株QDA相比提高到8．18倍。     

几种红藻和蓝藻藻胆体的分离和光谱特性

本文分析了高等红藻龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)藻胆体的吸收光谱和荧光光谱,并与低等红藻条斑紫菜(Porphyra yezoensis)及蓝藻钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)作了比较研究。龙须菜藻胆体的吸收峰位于498nm、541nm、565nm、620nm和650nm。荧光发射峰位于576nm和672nm。从光谱学性质和能量传递分析,龙须菜和条斑紫菜胆体的组成、结构相似,但有细微差别。而螺旋藻藻胆体的组成、结构则与两种红藻差别较大。     

几种红藻和蓝藻的光合作用色素

分离纯化出几种海产红藻和一种蓝藻的光合作用色素,并测定了它们的化学性质和光谱学性质。这些藻类是3种红藻:多管藻(Polysiphonia urceolata)、橡叶藻(Phycodrys sp.)和条斑紫菜(Porphyra yezoensis);蓝藻:钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)。用羟基磷灰石柱层析法从上述藻类中分离到几种不同的藻胆蛋白。经SDS-PAGE及光谱测定,发现条斑紫菜中的藻红蛋白不同于其它两种红藻。而橡叶藻中存在的两条藻红蛋白也有差异,条斑紫菜和钝顶螺旋藻中的两种别藻蓝蛋白之间也有区别。叶绿素分析表明,钝顶螺旋藻中叶绿素a的含量高于红藻中叶绿素a的含量。     

海藻中类胡萝卜素的提取及含量测定

许多研究已经表明，类胡萝卜素是分布最广泛、最重要的一类光辅助合成色素。类胡萝卜素具有多种生物学功能：作为化学保护剂可抵抗由植物自身叶绿素的光敏氧化作用引起的有害作用，给人体补充β-胡萝卜素可有效降低心血管疾病和癌症的发生概率，高摄入富含类胡萝卜素的饮食和降低白内障发生的危险之间有重要联系(Bendich，1993)。海藻中含有丰富的类胡萝卜素，从结构类型说，通常可以分为三类：胡萝卜素、叶黄素和类胡萝卜素酸。海藻中还含有多种特有的类胡萝卜素，如褐藻黄素、甲藻黄素、硅藻黄素等。直到目前为止，海藻中类胡萝卜素的组成与生理学功能尚没有明确的结论，因而对我国丰富的海藻资源中的类胡萝卜素进行较为系统和全面的化学及生物活性研究已成为摆在我们面前的一个重要课题。本研究选取我国青岛海滨三类大型经济海藻——红、绿、褐藻中资源量丰富的代表性种类作为实验材料，较系统地测定了其中类胡萝卜素的含量，并运用经典的柱层析法对各类胡萝卜素组分进行了分离，通过薄层分析和可见光谱扫描对各分离组分进行了定性、定量分析。     

裙带菜(Undaria pinnitifida)色素蛋白复合物的分离及光谱特性的初步研究

以褐藻裙带菜(Undaria pinnatifida)为实验材料，采用蔗糖密度梯度超速离心的方法纯化类囊体膜；以去污剂sDs为增溶剂(SDS：Chl=20：1，4℃增溶20min)，再用蔗糖密度为60％、50％、40％、30％、20％、15％和10％的梯度离心法，从裙带菜中成功地分离出5条含色素的蛋白质复合物带。离心结果显示在离心管顶部没有任何颜色，表明经过SDS增溶没有产生游离色素，纯化的类囊体膜和5条色素条带进行吸收光谱分析，显示了属于叶绿素n(Chl-a)的吸收峰：418、436和667到672nm。叶绿素c(Chl-c)的吸收峰：615和620nm。荧光发射最高峰位于682到690nm的区域。荧光激发光谱显示有Chl-a和Chl-c的激发峰，40％层带所含有的色素复合物只有属于Chl．n的吸收峰。分析结果表明：10％、15％层带所含有的色素复合物是褐藻的捕光色素复合物；20％、30％层带所含有的色素复合物是浅绿色的PSⅡ复合体(仍然含有捕光色素)，40％层带所含有的色素复合物是深绿色PSⅠ复合体，50％层带所含有的色素复合物是没有被增溶的类囊体膜。     

3种褐藻色素－蛋白复合物的分离及光谱特性

以非离子去污剂DMG增溶3种褐藻的类囊体膜 ,经SDS PAGE分离色素 蛋白质复合物 ,并测定其光谱特性及表观分子量。结果表明 ,3种褐藻的电泳分离结果完全相同 ,都分离到6条含色素的蛋白质复合物。从不同褐藻类囊体膜上得到的同一种复合物的吸收光谱和荧光发射光谱特性一致 ,3种褐藻的PSI复合物都有位于715nm处的长波荧光发射峰。电泳方法测得3种褐藻同一种色素 蛋白质复合物的表观分子量相近。     

褐藻小粘膜藻的化学成分

应用正相硅胶、生物胶Bio-Beads、凝胶Sephadex LH-20柱色谱和反相HPLC等层析方法,从小粘膜藻(Leathesia nana)中分离得到7个化合物,通过IR、MS、1D和2DNMR等波谱技术鉴定为4-羟基苯甲酸(1)、3．羟乙酰基吲哚(2)、2,3-二溴．4,5-二羟基苯甲醛(3)、3-溴-4,5-二羟基苯甲醛(4)、2,3．二溴-4,5．二羟基苯甲基乙醚(5)、双-(2,3-二溴-4,5-二羟基卞基)-醚(6)和3．溴-4．(2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲基)-5-甲氧甲基苯二酚(7)。     

两种褐藻乙醇提取物的抗氧化活性研究

为了获得具有抗氧化活性的天然海洋生物活性物质 ,本文利用褐藻门马尾藻属的两种海藻———鼠尾藻(SargassumthunbeergiiKuntze)和海黍子 (SargassumKjellamanianumYendo)的乙醇提取物 ,通过对DPPH·清除效率来评价其抗氧化活性。结果表明 ,两种褐藻提取物均有很强的抗氧化活性 ,在酚浓度为30mg/L时对DPPH·清除率分别高达95.5 %和92.3 % ,明显高于茶多酚及人工合成抗氧化剂BHT和TBHQ对DPPH·清除效率 (73.0 %以下 )     

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)dbEST中筛选微卫星位点及引物种间转移扩增

采用电子查询的方法，借助Blast软件从条斑紫菜表达序列标签数据库的20979条序列中筛选微卫星位点，共发现非冗余微卫星位点211个，占整个条斑紫菜EST数据库的1．01％。其中双碱基重复微卫星位点共有35个，占查找微卫星序列总数的16．6％；三碱基微卫星有176个，占83．4％。双碱基重复微卫星中AG／CT形式最多，而三碱基中GGC／GCC最多。从筛选出的微卫星位点中选取序列设计合成引物，用在坛紫菜上进行引物种间转移扩增研究。在总共15对引物中有13对引物在两个种间都有扩增产物。结果表明，微卫星位点在这两种紫菜之间具有很高的同源性。获得的微卫星引物可用来进行种群遗传多样性研究、谱系鉴定和遗传图谱的构建。而微卫星标记的共显性可用来进行紫菜二倍体丝状体纯合性检验，为纯系紫菜品系的鉴定提供分子生物学鉴定方法。     

二次电泳法分离管藻目绿藻PSI亚复合物研究

通过PAGE分离管藻目绿藻刺松藻和假根羽藻的PSI复合物CPIa，和CPI，二次电泳分析得到了多种亚复合物组分，其中包括PSI捕光复合物LHCI和不含LHCI的核心复合物CCI等。该方法研究为进一步研究管藻目PSI复合物的结构打下了基础。     

褐藻酸降解菌的发酵培养及褐藻酸酶对褐藻细胞的解离作用

褐藻酸降解菌埃氏交替单胞菌菌株Ａ１０２发酵培养时褐藻酸酶形成条件研究表明，其产酶的培养基最适褐藻酸钠含量为０．３￣０．６％，氮源为０．５％的蛋白胨，ｐＨ７．５，装量是在５００ｍｌ三角瓶中装培养基２００ｍｌ。