Co-modification of IL-2-TNFα fusion gene and B7.1 gene to murine breast tumor cells leads to improved tumor rejection and vaccine effect

Objective To improve the vaccine potency of gene-modified tumor cells.Methods Using recombinant adenoviruses, we expressed the B7.1 gene in murine breast tumor cell line EMF(6) and a subline previously transfected with retrovirus vector XdF harboring the IL-2-TNFα fusion gene.Results Immunization/challenge experiments demonstrated that IL-2-TNFα/B7.1 co-modified tumor cells possessed a lower tumorigenicity in vivo and an improved tumor-specific vaccine potency compared with single gene transfectant (P<0.05). Three weeks after immunization with a variety of tumor cells, the mixed lymphocyte and tumor cells reaction assay (MLTB) and (51) Cr-release assay were performed to test cellular immunity function. The results indicated that IL-2-TNFα and B7.1 together induced a more potent antitumor immune response than either molecule alone, 25% higher than IL-2-TNFα and 20% higher than B7.1, respectively.Conclusion The IL-2-TNFα fusion gene and B7.1 gene act in concert to improve their antitumor effectiveness.     

B7修饰的肿瘤细胞疫苗体内外抗肿瘤作用

目的：研究小鼠Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用，方法：应用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７－１和Ｂ７－２导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ－６细胞株中，Ｇ４１８筛选后获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素处理制备成肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ），观察ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对不同肿瘤细胞系的抗瘤活性及对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用。结果：（１）ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对亲本肝癌细胞和小鼠     

双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1 H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。     

B7修饰的肿瘤细胞疫苗体内外抗肿瘤作用

目的：研究小鼠Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用。方法：应用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７１和Ｂ７２导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株中，Ｇ４１８筛选后获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素处理制备成肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ），观察ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对不同肿瘤细胞系的抗瘤活性及对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用。结果：①ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对亲本肝癌细胞和小鼠ＮＫ敏感的Ｙａｃ１细胞的体外细胞毒作用明显增强；②在免疫模型中，经ＴＣＶＢ７免疫的小鼠，能对同系肝癌细胞产生完全的免疫保护作用，并能保持无瘤状态长期存活；③在早期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，能部分产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用，肿瘤的生长速度减缓，荷瘤小鼠的生存期延长。肿瘤组织（尤其是肿块包膜下）中淋巴细胞浸润增加；④在晚期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，未能产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用。结论：Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗能明显刺激增强体内外抗肿瘤作用。     

脂多糖和IL-2对乙型肝炎疫苗体外诱导B细胞应答研究

目的在乙型肝炎疫苗体外诱导B淋巴细胞产生HBs-Ab过程中，通过脂多糖和IL-2作为有效刺激物质，使用多秆组合方法进行观察比较，了解影响抗体产生的体外诱导因素。方法用乙型肝炎疫苗刺激组（A组）、乙型肝炎疫苗＋脂多糖刺激组（B组）、乙型肝炎疫苗＋脂多糖＋IL-2刺激组（C组）三组进行淋巴细胞培养和诱导，比较HBs-Ab产生情况，用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定HBs-Ab含量。结果在脂多糖和IL-2的刺激诱导下。能有效促进B淋巴细胞产生HBs-Ab。结论实验证明脂多糖是激活人血B淋巴细胞的有效丝裂原，IL-2可促使活化B细胞增生及产生抗体，脂多糖和IL-2联合作用，可增强乙型肝炎疫苗诱导体液免疫水平。     

IL-13Rα2在肿瘤研究中的进展

近年来对肿瘤的治疗,越来越倾向于靶向治疗.所谓靶向治疗,即是在细胞分子水平上,针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子,也可以是一个基因片段)来设计相应的治疗药物,药物进入体内会特异地选择致癌位点来结合发生作用,使肿瘤细胞特异性死亡,而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞,所以分子靶向治疗又被称为"生物导弹".靶向治疗能高效并且选择性地杀灭肿瘤细胞,并且对正常组织的损伤很小.经过多年研究证实白介素13受体(IL-13R)α2在肿瘤细胞中高表达而在正常细胞不表达或者低表达[1-5],所以近年来IL-13R在细胞毒素靶向治疗中常作为特殊的肿瘤细胞表面标记物.     

S-100β蛋白、IL-1β、IL-6和α-TNF的表达在全膝置换术后认知功能障碍的相关性研究

[目的]探讨老年患者术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)与血清S-100β蛋白、IL-1β、IL-6和α-TNF表达的关系.[方法]选择全麻下行单侧全膝置换术老年患者45例,术前1d、术后1d采用简易智能量表(MMSE)评价患者认知功能,以术后1d评分较术前1d降低2分或以上者归为POCD组(19例),下降少于1分或上升者归为非POCD组(26例).并于诱导前、术毕和术后1d采血检测S-100β蛋白、IL-1β、IL-6和α-TNF.[结果]与麻醉诱导前相比,术毕时两组患者血清S-100β蛋白、IL-1β、IL-6和α-TNF均明显升高(P＜0.05),但两组间无明显差异(P＞0.05).术后1d仅POCD组IL-6较术前明显升高(P＜0.05),且与非POCD组相比也明显升高(P＜0.05).[结论]全麻下行单侧全膝置换老年患者发生POCD与术后血清中IL-6表达关系较密切.     

EHF疫苗接种者 IL-12、sICAM-1、CD28分子及B7-2基因检测

目的探讨EHF疫苗接种机体后细胞免疫应答的机制.方法EHF双价灭活疫苗接种健康志愿者,采集接种前后静脉血分离血清和淋巴细胞.ELISA法检测免疫前后血清中IL-12、sICAM-1表达水平;IFA测定免疫前后淋巴细胞上CD28的表达;PCR-SSP检测免疫前淋巴细胞的B7-2基因.结果免疫后血清IL-12、sICAM-1表达水平升高,单因素方差分析有统计学差异;免疫前后淋巴细胞上CD28表达,x2检验示有显著性差异;PCR-SSP方法检测免疫前淋巴细胞B7-2基因阳性5人,其中汉族3人,侗族1人和布依族1人.结论EHF灭活疫苗接种健康志愿者后,显示机体产生了Th细胞介导的免疫应答.     

人类IL-3受体α亚单位与小鼠AIC2B蛋白的相互作用

目的　探索人类IL - 3受体 (IL - 3R)α亚单位与小鼠内源性AIC2B蛋白在诱导细胞增殖信号表达过程中的相互作用。方法　通过PCR扩增技术 ,构建了IL - 3Rα亚单位胞浆域缺失突变子 34、2 2和CD ,然后将野生型和突变型IL - 3Rα亚单位cDNA分别转染到含小鼠IL - 3R基因表达的BaF3细胞 ,并检测了阳性转染子的增殖信号传导和酪氨酸磷酸化。结果　表达野生型hIL - 3Rα/ βc的BaF3阳性对照克隆在生理浓度hIL - 3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白 βc、Jak2及Shc磷酸化 ;而含野生型IL - 3Rα亚单位和AIC2B的BaF3细胞可出现高浓度hIL - 3刺激的细胞增殖反应 ,但无信号传导分子的活化 ;共表达突变型IL - 3Rα与AIC2B的BaF3细胞及未转染的BaF3细胞则对各种浓度的hIL - 3刺激均无反应。结论　尽管hIL - 3Rβc亚单位在hIL - 3诱导的信号传导过程中担负关键作用 ,但小鼠内源性AIC2B也可与hIL - 3Rα重建功能性hIL - 3R ,这种功能的表达需要hIL - 3Rα完整受体分子的存在     

IL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒联合HBV DNA疫苗治疗HBV转基因小鼠效果评价

目的 评价融合蛋白基因质粒(pFP)联合在体电脉冲(EP)介导的HBV DNA疫苗(pS2.S)免疫HBV转基因(Tg)小鼠的治疗效果.方法 HBV Tg小鼠随机分成3组,每组5只,分别为pS2.S pFP、pS2.S PcDNA3.1免疫治疗和PcDNA3.1对照组.联合免疫质粒总剂量40 μg/只,按1:1比例混合接种.初次免疫后第4、8周分别进行第一、二次增强免疫,免疫前后分别检测血清学、组织学及HBV特异性免疫应答.结果 HBVDNA血清定量检测结果,pS2.S pFP组免疫第8周(13 317±2 539)拷贝/ml、第12周(6 462±3 359)拷贝/ml时分别较免疫前(36 159±7 769)拷贝/ml明显减低,差异具有统计学意义(P<0.01);pS2.S pcDNA3.1组第4周(20 618±9 523)拷贝/ml及第8周(23 818±5 319)拷贝/ml时均较其免疫前水平(36 090±4 421)拷贝/ml明显降低(P<0.01),但不能持续到12周(27 691±13 071)拷贝/ml,并明显高于此时pS2.S pFP组水平,差异有统计学意义(P<0.01);观察终点(12周)pS2.S pFP组Tg小鼠个体血清HBV DNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的 升高.结论 Th1类细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白基因表达质粒能够增强HBV DNA疫苗抑制Tg鼠HBV DNA复制和表达的治疗作用.     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

2型糖尿病与柯萨奇B组病毒感染及IL-6、TNF-α的相关性

目的探讨2型糖尿病(T2DM)与柯萨奇B组病毒感染关系,分析T2DM并柯萨奇B(CoxB)组病毒感染患者血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素6(IL-6)的水平意义。方法随机收集40例T2DM及38例健康对照组,检测CoxBIgM、CoxB中和抗体,测定IL-6、TNF-α、空腹胰岛素(FINS)、血糖(BG),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),比较上述指标在糖尿病患者与正常人群之间、T2DM并柯萨奇B组病毒感染与无柯萨奇B组病毒感染的T2DM的差异,分析TNF-α、IL-6与胰岛素抵抗的关系。结果T2DM患者中CoxBIgM、CoxB中和抗体明显高于对照组;T2DM并CoxB感染患者BG、HOMA-IR、TNF-α、IL-6明显高于无CoxB感染的T2DM。结论CoxB感染在T2DM的发生发展有一定作用,可能与TNF-α、IL-6作用相关。     

B7.1转基因肿瘤疫苗与大蒜素联合治疗膀胱癌的初步研究

目的初步估计大蒜素与B7.1转基因肿瘤疫苗对膀胱肿瘤的联合抗肿瘤效果.方法采用脂质体将B7.1基因导入鼠膀胱肿瘤(MBT-2)细胞.B7.1分子的表达经免疫荧光染色而测得.利用混合淋巴细胞培养MTT法,观察MBT-2-B7.1细胞刺激脾淋巴细胞的增殖作用.用MTT法测定了大蒜素对肿瘤细胞体外生长的影响.通过动物实验测定该肿瘤疫苗与大蒜素对膀胱肿瘤的联合治疗效果.结果转染了B7.1基因的肿瘤细胞能有效地刺激脾淋巴细胞增殖.当与大蒜素联合应用时,明显延迟了肿瘤的发生,并有效抑制了肿瘤的生长.结论大蒜素与转基因肿瘤疫苗治疗相结合能显著增强抗肿瘤效果.     

2型糖尿病与柯萨奇B组病毒感染及IL-6、TNF-α的相关性研究

目的 探讨2型糖尿病（T2DM）与柯萨奇B组病毒感染关系;分析T2DM并柯萨奇B（CoxB） 组病毒感染患者血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）及白细胞介素6（IL-6）的水平意义。方法 随机收集 40例T2DM及30例健康对照组,检测CoxB IgM、CoxB中和抗体,测定IL-6、TNF-α、空腹胰岛素（FINS）、血糖（BS）,计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）,比较上述指标在糖尿病患者与正常人群之间、T2DM并柯萨奇B组病毒感染与无柯萨奇B组病毒感染的T2DM的差异,分析TNF-α、IL-6与胰岛素抵抗的关系。结果 T2DM患者中CoxB IgM、CoxB中和抗体明显高于对照组;T2DM并CoxB感染患者BG、HOMA-IR、TNF-α、IL-6明显高于无CoxB感染的T2DM。结论 CoxB感染在T2DM的发生发展有一定作用,可能与TNF-α、IL-6作用相关。     

乳杆菌Lb.casei Zhang诱生小鼠脾细胞IL-2和IL-2Rα的作用

目的:研究乳杆菌Lb.casei Zhang对小鼠脾细胞IL-2和其受体IL-2Rα的诱生作用,从基因转录水平探讨其免疫调节的特点.方法:利用分离自酸马奶,并经过耐酸性实验、人工胃肠消化液中存活能力筛选的Lb.casei Zhang,制备活菌制剂分高、中、低三个剂量组灌服小鼠,分别于第3、7、11、15d,摘取脾脏,计算脾指数,RT-PCR法测定脾脏中IL-2和IL-2Rα mRNA的转录水平.结果:脾指数在连续灌服7d后开始明显增加,至11d时仍保持较高水平,并具有一定的剂量依赖效应;IL-2和IL-2Rαt mRNA的转录水平与脾指数相适应在连续灌服7d后开始明显增加,至11d时达到高峰,且具有一定的剂量依赖效应.结论:乳杆菌Lb.casei Zhang能够诱导脾脏淋巴细胞自分泌生长因子IL-2及其活化受体IL-2Rα的转录及分泌,进而激活Th1细胞,从而发挥免疫调节作用.     

联合应用MAGE-1与IL-18基因疫苗体外抗肝癌作用的实验研究

目的该研究构建重组基因疫苗pcDNA-MAGE-1和pcDNA-hIL-18;探讨联合应用基因疫苗体外抗肝癌免疫治疗的作用。方法基因疫苗分组免疫实验小鼠,在体外验证疫苗免疫后的小鼠脾细胞对MAGE-1阳性和阴性肝癌细胞株的杀伤作用;分别以不同剂量的pcDNA-hIL-18与pcDNA-MAGE-1组合测定免疫鼠脾细胞杀伤率,验证产生高杀伤效应的最佳的pcDNA-hIL-18浓度。结果重组基因疫苗免疫组小鼠脾细胞对两种MAGE-1阳性肿瘤细胞(SMMC-7721、BEL-7402)均有明显的杀伤作用,其杀伤效应与生理盐水组(空白对照),空质粒pcDNA3组(阴性对照)相比差异具有显著性(P<0.01);重组基因疫苗免疫后的小鼠脾细胞对MAGE-1阴性肿瘤细胞(QQY-7701)有一定的杀伤作用,与空白对照及阴性对照免疫组相比差异有显著性(P<0.05);pcDNA-hIL-18+pcDNA-MAGE-1组以(50+100)μg剂量免疫小鼠的脾细胞杀伤效应最高,与pcDNA-MAGE-1和pcDNA-hIL-18组相比差异有显著性(P<0.01)。结论联合应用MAGE-1与IL-18基因疫苗对MAGE-1阳性肿瘤...     

聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化和制备

目的建立聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化方法.方法运用Superdex75Highload制备型凝胶色谱柱,以含0.15mol/LNaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,流速为1.5ml/min,检测波长为215nm.结果各洗脱组分经SDS-PAGE检测呈单一条带.聚乙二醇修饰干扰素α2b的蛋白回收率为36.5%,抗病毒活性回收率为4.3%,比活度为4.74×10\\+7IU/mg,是原形干扰素α2b的10.4%.结论这种方法可以用于制备聚乙二醇修饰干扰素α2b.     

mIκBα基因转染肝癌细胞HepG2的放射增敏作用

目的 探讨mIκαBα基因是否增加肝癌细胞的放射敏感性.方法 实验分3组:亲本细胞对照组、nepG2细胞转染Adv组、转染mIκBα基因的Hep G2细胞-Ad mIκBα组.在6 Gy X射线照射前后分别测定3组细胞下列指标:Western blot检测肝癌细胞浆内mIκαBα值;电泳迁移率法测定肝癌细胞核内NF-κB活性;TUNEL染色法测定肝癌细胞凋亡指数.2 Gv放射线照射后的肝癌细胞存活分数和用多靶单击模型确定的Do、Dq值判定肝癌细胞的放射敏感性.结果 放射线照射前,Adv组与Hep G2组细胞浆内mIκBα呈低值,照射后更减低;而细胞核内NF-κB活性照射前为( ),照射后为( ),呈持续激活状态;细胞凋亡指数在照射前分别为1.4、1.6,照射后升高至8.9、11.7.Ad mIκBα组在照射前、后细胞浆内mIκBα均呈高值,均为Adv组的3倍;而细胞核内NF-κB活性在照射前、后均呈阴性;照射前细胞凋亡指数为18.2,照射后升高至88.3.3组中Ad mIκBα组细胞存活分数最低,为0.301;而SER(放射增敏比)最大,为2.099;Do值最小,为1.468.Dq值最小,为0.709.结论 用mIκBα基因转染肝癌细胞Hep G2,可抑制肝癌细胞内NF-κB的抗凋亡活性.增强肝癌细胞的放射敏感性.     

用射线照射的B7-1转基因细胞进行肿瘤疫苗的研究

目的探讨用放射的B71转基因细胞进行肿瘤疫苗疗法的效果。方法将重组人B7-1基因真核表达载体导入CAK-1肾细胞瘤细胞,利用转基因细胞治疗观察其抗肿瘤效果。结果转基因细胞的肿瘤原性较CAK-1／Wt、CAK-1／pCDNA3组明显降低（P〈0．001）。同时免疫原性明显增强,以^60Co照射的CAK-1／B7-1细胞免疫后,小鼠体内诱发了抗CAK-1／Wt的系统性、保护性免疫。用^60Co灭活的转基因细胞作为瘤苗进行实验性治疗,能够延长小鼠的生存时间,减慢肿瘤的生长速度,CAK-1／H7-1的应用提高了肿瘤治疗效果（P〈0．01）。结论放射的转基因细胞及其表达的H7细胞因子可以有效地激发机体的抗肿瘤免疫应答,B71表达肿瘤细胞应用可以成为一种很有前景的肿瘤疫苗。     

人肝癌细胞与自体激活B淋巴细胞融合制备肿瘤疫苗

目的：观察３例人肝癌组织细胞与其自体激活Ｂ淋巴细胞融合后融合细胞表面分子ＧＰ７５和免疫相关分子ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ和Ｂ７的表达情况，以便为肿瘤疫苗向临床试验过渡提供人体细胞的实验依据。方法：应用聚乙二醇（ＰＥＧ）法将人肝癌细胞与其自体激活Ｂ淋巴细胞融合，利用流式细胞仪观察融合细胞表面分子ＧＰ７５和免疫相关分子ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ和Ｂ７的表达情况。结果：融合细胞表面不仅表达肝癌细胞表面的ＧＰ７５分子，还可表达共刺激分子Ｂ７及ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ。结论：人肝癌细胞与其自体激活的Ｂ淋巴细胞融合后的杂交瘤细胞既能表达肝癌细胞表面分子ＧＰ７５，又可表达共刺激信号分子，从而为这一形式的肿瘤疫苗向临床试验过渡提供了实验依据