检测兽用疫苗中支原体污染的PCR-ELISA技术的建立及应用

建立了检测兽用疫苗中支原体污染的PCR-ELISA方法,探索其最佳实验条件及优化组合。实验依据GenBank中登录的鸡源支原体和猪源支原体16SrRNA基因序列(登录号:Mg,AY744942;Mhp,AE017244;Mhs,AY973563;Mf,X63377),运用DNAStar软件和Primer5.0软件设计PCR特异性引物和探针,其中引物用地高辛标记,探针用生物素标记。以培养的支原体中提取的DNA为模板,依据PCR-ELISA技术原理设计实验,建立并优化PCR-ELISA反应条件。对30批鸡新城疫Ⅰ系活疫苗、30批鸡新城疫La Sota系活疫苗样品和30批猪瘟活疫苗样品进行检测。结果表明,应用建立的PCR-ELISA反应体系和条件可以从疫苗样品中检测到支原体,检测率为35.6%,比PCR法的检测率高11.2%。该方法灵敏度高,特异性强,在疫苗的支原体污染检测中具有推广应用价值。     

牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究

牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用.     

绵羊肺炎支原体hlyA基因的表达及活性初步鉴定

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)可引起绵羊(Ovis aries)及山羊(Capra hircus)的支原体性肺炎,分布广泛,危害严重.本实验在课题组前期完成MO Y98株基因组测序的基础上,通过基因注释、PCR等获得了该菌株可能的溶血素(hemolysin,hlyA)基因;依据大肠杆菌(Escherichia coli)优势密码子对hlyA基因进行优化,构建优化后hlyA原核表达质粒pET32a-hlyA;将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,获得了相应的重组菌株,并对重组菌株进行诱导表达;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定,并经Ni2+金属螯合柱纯化.克隆了MO hlyA基因序列(GenBank登录号:KT598390),片段大小为375 bp,编码125个氨基酸.优化后密码子适应指数为0.91,目的基因适于在大肠杆菌中表达.重组融合蛋白多以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为31.6 kD,与预期大小一致.Western blot结果显示,上清中纯化出的目的蛋白能与一抗发生反应,重组蛋白特异性较好.溶血实验表明,当纯化后蛋白浓度稀释到0.125 μg/mL时,溶解红细胞的能力已经下降.该研究结果为后续绵羊肺炎支原体致病性研究提供了基础资料.     

鸡毒支原体的假定细胞粘附素基因鉴定及用作DNA探针的研究

鉴定了鸡毒支原体的假定细胞粘附素基因的一部分,并将其用作ＤＮＡ诊断探针。根据肺炎支原体细胞粘附素蛋白质的基因保守区两侧序列,设计并合成一对变性寡核苷酸引物Ｌ２Ｒ２,用于以鸡毒支原体Ｓ６株基因组ＤＮＡ为模板的ＰＣＲ反应。扩增获得一个长８５４ｂｐ的ＤＮＡ片段,随后进行了克隆和测序。同源性分析表明扩增片段与肺炎支原体细胞粘附素基因相应部分具有显著的一致性。回收鸡毒支原体假定细胞粘附素基因扩增片段,制成地     

环介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体

利用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法建立了猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoinae）的快速检测方法。该方法以猪肺炎支原体保守性基因16SrRNA为靶序列设计了6条特异引物,在63℃等温条件下,30min即可完成反应。结果显示,LAMP技术优于PCR技术。在敏感性实验中,LAMP方法的能检测出10个包含靶基因片段的重组质粒,敏感性高于PCR方法10倍;特异性实验中,LAMP方法和PCR方法均显示出了高度的特异性;在对127个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果是所有样本都为阳性,而PCR检测出了116份阳性。证明本研究所建立的方法,对临床样本的检测的敏感度高于常规的PCR法。LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济的特点,在研究机构以及基层实验室、现场监测的广泛使用具有一定的潜力。     

牛支原体pdhα和pdhβ基因的克隆、原核表达及亚细胞的定位

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病.丙酮酸脱氢酶复合体E1 (pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化.本研究参照GenBank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα (GenBank登录号:KU355295)及pdhβ基因(GernBank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR (Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒pET-pdhα和pET-pdhβ.表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropy1β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E 1α亚基融合蛋白PDHA及PDHcE1β亚基蛋白PDHB.纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHcE1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究.结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白rPDHA及rPDHB的分子量分别约为40和37kD,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当.本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料.     

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因(pdha)的克隆、表达及其免疫学活性测定

丙酮酸脱氢酶α-亚单位(PDHA)在病原体丙酮酸脱氢酶的催化过程中发挥着重要作用。为表达绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)PDHA蛋白并测定其免疫学活性,应用PCR方法扩增出绵羊肺炎支原体pdha基因并对其序列进行分析,将pdha基因中色氨酸密码子TGA优化为TGG后进行全基因合成,插入到pET32-a(+)载体上,构建了pET32-a(+)-pdha重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中诱导表达PDHA蛋白,并通过免疫印迹及小鼠(Mus musculus)免疫试验对其免疫学活性进行测定。结果pdha基因全长1125bp,编码375aa,(G+C)%为34.76%,第304~306位、379~381位、586~588位、592~594位、625~627位、811~813位、889~891位及964~966位TGA在支原体中编码色氨酸而不是作为终止密码子;基因序列比对及进化树分析显示,绵羊肺炎支原体pdha基因与10种支原体的pdha基因序列同源性为32.6%~85.3%,氨基酸序列同源性为39.3%~90.6%,基因序列和氨基酸序列均与猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)有同源性,分别为85.3%和90.6%;绵羊肺炎支原体pdha基因在33℃、IPTG0.25mmol/L诱导6h的表达条件下,表达量最高;重组的PDHA蛋白可与绵羊肺炎支原体高免血清具有免疫印迹条带,在免疫小鼠后血清抗体效价与对照组相比,均显著升高(P<0.05)。本实验首次成功克隆表达了绵羊肺炎支原体pdha基因,并证明其重组PDHA蛋白具有较好的免疫学活性。为绵羊支原体肺炎基因工程疫苗及诊断研究提供候选靶标。     

山羊支原体山羊肺炎亚种SYBR GreenⅠqRT-PCR检测方法的建立

山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊传染性胸膜肺炎(contagious capri pleuropneumonia,CCPP)的病原。本研究根据GenBank公布的Mccp F38株(No.LN515398.1)arcD(MCCPF38_00114)基因序列设计1对特异性引物,建立了针对Mccp的SYBR GreenⅠ qRT-PCR方法。结果显示,该方法能特异性检测Mccp,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri,Mmc)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)、绵羊肺炎支原体(Myplasma ovipenumoniae,Mo)、羊传染性脓疱毒(Orf virus,ORFV)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)、大肠杆菌(Escherichia coli,Ec)等羊常见病原均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性;该方法的最低检测限为279 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%,说明该方法灵敏度高、重复性好。本研究建立的检测Mccp arcD基因的SYBR GreenⅠ qRT-PCR方法为CCPP的临床早期诊断及定量分析Mccp感染水平提供了更准确的方法。     

牛支原体生物被膜形成优势菌株的筛选及培养条件的优化

牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是牛(Bos taurus)的重要致病性支原体,其生物被膜的形成在宿主细胞中产生持续性感染,使养牛业造成重大的经济损失。因此,本研究旨在通过对Mb不同菌株生物被膜形成能力的鉴定,筛选出1株生物被膜形成优势菌株,并对其培养条件进行优化,以期为Mb生物被膜相关的研究提供生物材料。首先应用微孔板定量检测法鉴定Mb PG45株、湖北株(HB株)、武威株(WW株)、定西株(DX株)和临洮株(LT株)生物被膜的形成能力;进而以生物被膜形成能力强的菌株作为模式菌株,完成对Mb生物被膜形成培养条件的优化。结果显示,Mb不同菌株形成生物被膜的能力不同,其中临洮株生物被膜形成能力最强,湖北株生物被膜形成能力次之,PG45株、武威株和定西株生物被膜形成能力最弱。取浓度为1.7E+08 CFU/mL的Mb液体培养物,按1∶10转接种于含0.01 mg/mL DNA、20%马血清和1%葡萄糖的Eaton培养基(pH 8.5),于37℃、5%CO2条件下培养72 h,Mb生物被膜的形成最佳。本研究筛选获得1株生物被膜形成能力强的Mb,并通过培养条件的优化,使之形成稳定且明显的生物被膜,从而为Mb生物被膜相关研究提供了良好的生物材料。     

伟大的战略 跨世纪的工程

<正>在全党和全国人民正以饱满的热情迎接党的十五大召开之际,江泽民总书记、李鹏总理等党和国家领导人就治理水土流失,建设生态农业问题作了重要批示,要求“再造一个山川秀美的西北地区”,黄土高原水土流失治理“争取15年初见成效,30年大见成效.”江泽民总书记和李鹏总理的批示,高瞻远瞩,高屋建瓴,涵盖历史,充分肯定和高度赞扬了延安、榆林地区及黄土高原治理水土流失,建设生态在业所取得的巨大成就,并对今后进一步加快水土流失治理开发步伐,改善生态环境,促进区域经济持续、快速、协调发展指明了方向,提出了殷切的希望和要求.这充分体现了党的第三代领导集体对水土保持工作的重视、支持和关心,对水土流失区广大人民群众的巨大关怀,是对全国特别是对水土流失区广大干部群众的巨大鼓舞和鞭策.我们一定要认真学习、深刻领会、坚决贯彻执行.     

土壤的农业化学研究的任务

在米丘林文库中,保留着一篇未完的论文稿:“向科学家要求些什么”。在这篇论文里,米丘林对于那些不能给最需要的农业问题以适当解決的学者,愤怒地写道:“例如,第一个问题:园艺家应该知道,这个区域的土壤是否适宜栽种这些植物?土壤中缺乏什么?它需要加入那些物质?并且,土壤中有什么是过多的?”     

被土壤吸附的六价铬的最佳提取剂的选取

通过研究土壤中磷酸盐与Ｃｒ（Ⅵ）的竞争吸附作用，查明０．１ｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４溶液是提取被土壤吸附的Ｃｒ（Ⅵ）的最佳提取剂。     

土壤Se的分级与Se的植物有效性的关系

Nine soils with distinct properties and Se levels were selected to test a fractionation procedure of soil Se based on sequential extraction. Soil Se was fractionated into readily available Se (fraction Ⅰ, extracted by 0.5 M NaHCO₃), slowly available Se (fraction Ⅱ, extracted by 0.1 M NaOH-0.1 M Na₄P₂O₇), amorphous oxide-occluded Se (fraction Ⅲ, extracted by acid ammonium oxalate), free oxide-occluded Se (fraction Ⅵ, extracted by dithionite-citrate-bicarbonate buffer solution) and residual Se (fraction Ⅴ, determined by HNO₃-HClO₄ digestion of the final soil residue). The recovery of soil Se (the sum of all fractions over total soil Se determined independently) by this procedure was from 88.1% to 110.9%, mean 99.2%±6.4% for the test soils. The sum of fractions Ⅰ and Ⅱ, provided a good measure of available Se in soils and the percentage of fraction Ⅰ plus Ⅱ over the total soil Se, tentatively defined as Se availability index, could be used to indicate soil Se status and predict Se deficiency.     

施用重金属含量高的污泥的土壤重金属的有效性

<正> 为了确定Cd、Cu、Ni和Zn对生长在施用污泥的土壤上的玉米的有效性,于1984年,在就地侧渗能控制的小区进行田间试验。这些小区设在三种土壤上。这三种土壤为Bojac壤质砂土,Davidson粘壤土和Grosecloge细壤土。来自主要处理工业废水的     

氨的固定对土壤微生物氮的测定的影响

The effect of ammonium fixation on the estimation of soil microbial biomass N was studied by the standard fumigation-incubation(FI) and fumigation-extraction (FE) methods,NO3-N content of fumigated soil changed little during incubation,while the fixed NH4^ in soils capable of fixing NH4^ increased with the increase of K2SO4-extractable NH4-N.one day fumigation increased both extractable NH4^ and fixed NH4^ ,However,prolonged fumigation gave no further increase.One day fumigation caused significant loss of NO3-N,while prolonged fumigation caused no further loss.For soils tested,the net increases of fixed NH4^ in fumigated soil equaled to 0-94% of NH4-N flush measured by the FI metod,and 1-74% of extractable N measured by the FE method.depending on different soils.It is concluded that the ammonium fixation was one of the processes taking place in soils during fumigation as well as incubation ofter fumigation and should not be neglected in the estimation of microbial biomass nitrogen by either FI or FE method.     

麦根酸的分泌及其对土壤中铁的有效性的影响

Large amounts of phytosiderophore are detected from both the solution and the rhizosphere soil when cereal crops are under Fe deficiency stress.The extension of phytosiderophore in the rhizosphere soil is found only within 1 mm apart from the root surface.The rate of phytosiderophore secretion is negatively related to chlorophyll content in young leaves and positively related to the Fe-solubilizing capacity.Results from in vitro experiments whow 10 μmoles mugineic acid can dissolve 501 μg Fe from iron hydroxide and 146 ug from strengite.Thus,phytosiderophore can considerably enhance the soil iron availability by increasing the solubility of amorphous iron hydroxide and iron phosphate,and active Fe is consequently accumulated in the plant rhizosphere,43% higher than in the bulk soils There is evidence to support that mugineic acid chelates with Fe%3 at a rate of 1:1 in the acid condition.In addition,we observe mugineic acid has certain effects on mobilization of P as well as Fe by dissolving the insoluble iron phosphate,And phytosiderophore seems to be an effective remedy for the chlorosis of dicotyledonous plants.     

基于Java的底层网络通信的实现

简要介绍了Socket通信机制中有连接和无连接两种方式不同的应用需求,并通过收发数据报的简单实例,阐述如何实现底层网络的通信。     

提高罐藏蘑菇的得率的研究

为了探讨提高罐藏蘑菇得率的更好方法，用正交试验设计方法进一步分析浸泡-冷藏-浸泡处理与浸泡-冷藏-真空水合处理方法中各因素以及蘑菇的预煮时间、预煮液中的柠檬酸浓度对罐藏蘑菇的得率的影响。试验结果表明，在浸泡-冷藏-浸泡处理与浸泡-冷藏-真空水合处理方法中，只有冷藏处理显著影响罐藏蘑菇的得率。蘑菇的预煮时间与预煮液中的柠檬酸浓度对罐藏蘑菇的得率也有较显著的影响。将蘑菇在2℃的条件下作20～24 h的冷藏处理后再预煮，并适当延长预煮时间可提高罐藏蘑菇的得率。