猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒，转化大肠埃希氏菌TOP10，经IPTG诱导，成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDSPAGE分析，在分子质量50．4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDSPAGE分离，并经透析得到了重组融合蛋白，以此融合蛋白免疫家兔，制备并纯化了抗pGH多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。     

猪CCL2的原核表达及其多克隆抗体的制备

CCL2作为一种典型的促炎因子,在病毒感染、各类肿瘤、自身免疫疾病等许多病症的发生、发展中都有着举足轻重的意义,然而猪的CCL2研究鲜有报道。本研究使用PCR方式扩增CCL2基因,将其克隆于大肠杆菌原核表达系统的pET-28a(+)表达载体中,成功构建重组表达质粒pET-28a(+)-CCL2,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,再经0.1mmol/L的IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明猪CCL2蛋白在大肠杆菌中获得可溶性表达。将CCL2蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,4次免疫后收集血清,通过ELISA方法检测其效价达到1∶128 000。Western blot和IFA测定结果显示本研究获得的猪CCL2多克隆抗体具有较好的特异性。本研究获得的猪CCL2蛋白和针对CCL2的兔多克隆抗体为未来研究猪CCL2的在疾病中的相关作用及生物学功能提供了试验材料。     

猪Viperin主要抗原区的原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增猪Viperin蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体p ET32a,转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白得到表达,分子质量约为40 ku。进一步优化蛋白表达条件为:IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导5 h。采用His标签单抗对重组蛋白进行Western blot鉴定表明蛋白具有良好的抗原性。将蛋白质纯化后免疫新西兰大白兔,间隔14 d免疫4次,并采集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,结果表明,经过4次免疫血清抗体效价达到1∶409600,间接免疫荧光检测出现特异荧光,表明其能与Viperin蛋白发生反应。本试验为研究Viperin的功能、建立特异的检测方法奠定了基础。     

猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。     

猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组N蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示：重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示：PDCoV N蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

烟碱酰胺合成酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以重组克隆质粒p0390-MF-NASHOR1为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出烟碱酰胺合成酶基因(nas)片段并将其克隆到原核表达载体pGEM-KG中,获得重组表达质粒pKG-NAS。将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,烟碱酰胺合成酶基因在大肠杆菌中成功表达,表达的烟碱酰胺合成酶融合蛋白分子量大约为61 kDa。将初步的纯化产物作为免疫原去免疫新西兰大白兔制备兔抗烟碱酰胺合成酶血清,用蛋白免疫印迹法(western blot-ting)对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定,显示该抗体具有较好的特异性。烟碱酰胺合成酶基因多克隆抗体的成功制备为检测该基因在草坪草中的表达提供了可靠的手段和技术平台,为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础。     

猪YTHDF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

YTH家族蛋白2(YTH domain-containing family protein,YTHDF2)作为一种m~6A修饰的结合蛋白,可对底物mRNA的剪接,翻译,降解等过程进行调控。本研究通过RT-PCR首次获得了猪YTHDF2编码基因序列,全长1 743 bp,编码580个氨基酸,基因进化树分析显示该基因在各物种间保守性较高。将猪YTHDF2编码基因克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,重组质粒pET-28a (+)-YTHDF2在大肠杆菌BL-21菌株中进行原核表达,成功获得了大量带His标签的猪YTHDH2重组蛋白,大小约70 kD。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备猪YTHDF2多抗血清,ELISA结果表明制备的兔抗猪YTHDF2多抗血清效价为1:204 800,间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验均表明该多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。猪YTHDF2基因序列的获得及多克隆抗体的制备为进一步研究YTHDF2在猪mRNA m~6A甲基化过程中的生物学功能奠定了基础。     

猪硒蛋白W的原核表达及IgY多克隆抗体制备

试验旨在优化硒蛋白W （selenoprotein W,SelW）的原核表达系统,并评估SelW的免疫原性和基于IgY抗体检测猪体内SelW的可行性。将获得的猪SelW基因序列密码子进行优化、合成并连接至pET-32a （+）表达载体中,构建原核表达重组质粒pET32a （+）-SelW,转化E.coli BL21（DE3）宿主菌中,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定重组猪SelW的表达情况,并免疫产蛋鸡制备抗SelW的IgY多克隆抗体,通过间接ELISA检测IgY抗体滴度,采用Western blotting检测IgY识别抗原的特异性。SDS-PAGE结果显示,SelW基因在原核细胞中成功表达,得到了大小约为33 ku的重组蛋白,IPTG最佳诱导浓度及时间分别为0.5 mmol/L和6 h;可溶性分析结果显示,重组蛋白SelW主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测结果显示,免疫后45 d的IgY多克隆抗体的效价可达1：51 200。Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IgY抗体与SelW的亲和力较高。本试验成功构建并优化了SelW蛋白的原核表达系统,提高了SelW蛋白的表达量,获得了具有良好免疫原性的SelW蛋白,制备的IgY抗体能特异性识别猪肌肉组织中的SelW,可用于检测猪组织中SelW的表达、预防硒中毒和缺硒性疾病的监测等,为进一步探究SelW的生物学功能奠定基础。     

猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的原核表达条件优化及多抗制备

探讨原核表达猪囊尾蚴TsCL-1的蛋白生物学特性,为半胱氨酸蛋白酶（Cysteine proteinase,CP）在猪囊尾蚴与宿主相互关系中的作用研究奠定基础。将含有猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的pGEX-4T-TsCL-1重组质粒转化入大肠杆菌BL21,进行诱导表达并对表达条件进行优化,应用免疫印迹法（Western blot）和动物试验进行重组蛋白的抗原性分析。经SDS—PAGE分析,表达的TsCL-1重组蛋白相对分子质量为61000,与推导结果一致。使用2×YT培养基于28℃、IPTG终浓度为0．1mmol／L的条件下诱导10h,可溶性重组蛋白表达量最高。Western blot检测结果表明,TsCL-1蛋白能与猪囊尾蚴多克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测血清抗体结果表明：制备的抗体能与TsCL-1重组蛋白特异性结合。成功诱导表达出了TsCL-1重组蛋白,表达产物的特异性、敏感性及稳定性良好。对猪囊尾蚴病的诊断及抗寄生虫新药物和疫苗研发提供了一定的理论依据。     

Sf9细胞PHB2蛋白的原核表达及其抗血清的制备

为了研究Sf9细胞PHB2蛋白(Sf-PHB2)的功能及其对虾白斑综合症病毒(WSSV)极早期基因ie1的转录调控作用,本研究从昆虫细胞Sf9中扩增sf-phb2基因编码区,克隆至表达载体pET30a中,转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达6His-Sf-PHB2重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达的重组蛋白以...     

猪FcRn胞浆尾区的克隆表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR方法从猪肝脏总RNA中克隆猪FcRn基因,然后利用PCR技术亚克隆猪FcRn胞浆尾区（FcRn-CT）,构建重组原核表达质粒KG-CT和pET32a-CT,分别在大肠杆菌BL21中获得了高效表达,并利用Glutathione Sepharose 4B和HisTrap FF crude亲和层析柱纯化目的蛋白。用纯化蛋白KG-CT免疫新西兰白兔,制备了多克隆抗体。利用纯化蛋白pET32a-CT建立了间接ELISA法,检测多抗效价达1∶32 000。Western blot检测结果表明该多抗特异性良好,为进一步研究FcRn在猪体内的表达分布及功能研究奠定了基础。     

水泡性口炎病毒M基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

为制备水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)重组M蛋白的鼠源多克隆抗体,本研究将扩增的VSV-M基因插入到pET-28a载体中,构建了pET-28a-VSV-M原核表达载体,将其转化至大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达;SDS-PAGE和Western blot检测结果发现重组蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为31 000。之后应用His GraviTrap 10prepacked gravity flow columns纯化重组M蛋白,并将其免疫小鼠,制备VSV重组M蛋白的多克隆抗体;间接ELISA方法检测其抗体效价为1∶12 800。将该抗体应用于VSV的检测,在稀释倍数为1∶800时仍可检测到清晰的条带,且大小与预期的一致,证实了其与病毒的特异性结合。结果表明,本研究成功构建了VSV-M蛋白的原核表达载体,将表达纯化后的VSV-M蛋白免疫小鼠成功制备了VSV-M蛋白的多克隆抗体,这为后期检测VSV-M基因的表达分布、功能特性及开发诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白在大肠杆菌中的高效表达和多克隆抗体的制备

克隆了NS1蛋白基因并构建了重组表达质粒pTIG-Trx-E-tag-NS1。该质粒在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导后获得了大量的可溶性表达蛋白,重组蛋白表达水平达到了细菌总蛋白的42.16%。经Anti-Etag进行Western blotting检测结果为阳性。后经金属螯和层析纯化获得纯度约为95%的蛋白样品,用纯化后的NS1蛋白直接作为抗原免疫家兔产生抗血清,经ELISA检测抗体效价达1∶256 000,通过Western blot检测,与商品化的抗E-tag单抗对照,显示NS1抗体获得了与抗E-tag单抗同样好的特异性。结果证明,成功地制备了特异性的NS1多克隆抗体。     

伪狂犬病毒SL株gL基因的克隆、原核表达、抗体制备及亚细胞定位

通过PCR从伪狂犬病毒(PRV)SL株基因组中扩增出gL基因,将产物亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,测序验证后将重组质粒转化至E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约33 000,同预期大小相符,通过Western blot检测可知重组蛋白具有较好的抗原性。使用Ni 2+-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经琼脂扩散试验测定,效价达1∶8。通过免疫荧光技术进行PRV gL亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4h的细胞质中检测到特异性荧光,并随着PRV的复制gL表达增加。试验结果为进一步研究gL基因的功能和PRV的致病机理提供了重要依据。