PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞cNMP的影响

目的 :观察PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的影响 ,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据。　方法 :将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸 (含第 1外显子部分序列 )与脂质转染试剂DOTAP共同转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞 ,以酶联免疫法分别检测转染后不同时间 (1～ 4 8h)海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的浓度变化 ,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内cNMP的影响。　结果 :转染后 ,反义实验组平滑肌原代细胞内cGMP水平 (1～ 6h)显著高于对照组 (P <0 .0 1)。　结论 :PDE5基因反义寡脱氧核苷酸可以增加人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平 ,本研究有助于了解PDE5基因与cNMP在阴茎勃起中的作用 ,并为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验基础。     

反义N-ras寡脱氧核苷酸对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨N-ras反义寡脱氧核苷酸（ASODN）对前列腺癌细胞增殖的影响。方法：针对N-ras基因转录、翻译起始区分别合成硫代修饰的ASODN，采用^3H-TdR掺入、流式细胞荧光免疫和斑点杂交法检测LNCaP细胞增殖和N-ras基因表达。结果：两种ASODN单独作用后，LNCaP细胞内N-ras mRNA、p21蛋白和PSA表达水平以及^3H-TdR掺入率明显低于对照组，10μmol/L浓度对细胞生长的抑制率分别达63％，51％；二者联合应用后，N-ras基因表达、PSA水平以及^3H-TdR掺入率进一步降低，细胞生长抑制率进一步增高达85％。结论：N-ras ASODN可有效抑制前列腺癌细胞增殖；同时证明N-ras在前列腺癌发生发展中起重要作用。     

针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2作用的研究

目的探讨针对于胰腺癌K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞株PC-2的作用。方法用脂质体将针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC-2（反义组）,转染正义寡脱氧核苷酸（正义组）和生理盐水（对照组）,免疫组化和原位杂交检测靶基因表达,人工计数、噻唑蓝（MTT）和集落形成实验检测细胞增殖情况。结果转染48h后,反义组ras蛋白和K-ras基因mRNA的表达强度较正义组和对照组均明显降低（P〈0．05）。人工计数、MTT检测和集落实验均证实反义组细胞增殖受到明显抑制（P〈0．05）。结论针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的胰腺癌细胞,对靶基因表达和细胞增殖有明显的抑制作用。     

反义寡脱氧核苷酸逆转人肝癌多药耐药性的实验研究

目的：探讨坂义寡脱氧核苷酸（ASPODNs)对人肝癌多药耐药基因（MDR）的逆转作用,方法：ASPONs作用于肝癌MDR细胞模型后,用MTT法检测其逆转作用,用逆转录PCR和流式细胞术检测其对4种MDR基因表达的影响,结果：ASPODNs抑制DR基因的表达存在时间－效应和剂量－效应关系,对单基因MDR细胞药性的逆转率为90．26％－100％,对多重MDR细胞耐药性逆转率70．09％－100％,结论：多种ASPODNs联合逆转多重MDR具有可行性并取得明显效果。     

腺病毒载体介导PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响

目的:观察腺病毒载体介导的PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响,探讨利用RNAi技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性。方法:利用构建的携带2条靶向PDE5 mRNA靶位点的shRNAs重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设立阴性对照组和空白对照组,于转染后24、48、72 h用钙离子荧光探针Fluo-3/AM进行染色,然后在激光扫描共聚焦显微镜下动态检测细胞内钙离子荧光强度,以平均荧光指数(FI)反映细胞内游离钙的相对水平。结果:实验组在转染PDE5-shRNAs重组腺病毒24、48、72 h后钙离子荧光指数分别为829.3±7.8、801.5±9.5、856.3±8.7,均明显低于阴性对照组的1106.3±10.8、1121.3±10.2、1058.5±12.1和空白对照组的1076.6±9.7、1133.4±11.2、1104.3±10.5,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腺病毒介导的靶向PDE5基因的shRNAs能够明显降低大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙水平。     

短发夹RNA对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型基因表达的抑制作用

目的 观察短发夹RNA(shRNA)对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型(PDE5)基因表达的抑制作用,探讨运用RNA干扰(RNAi)技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法 构建靶向大鼠PDE5基因的shRNA重组腺病毒rAd-rPDE5-shRNA,将其转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,通过荧光标签进行显微计数确定转染效率,并以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5基因的表达水平.结果 rAd-rPDE5-shRNA构建成功,转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞效率达95%以上,并使PDE5基因表达在mRNA水平抑制(80.78±2.30)%,在蛋白水平抑制(67.39±3.33)%.结论 以腺病毒为载体表达的shRNA能稳定、有效地抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因的表达.     

反义ICAM-1寡脱氧核苷酸抑制大鼠腹主动脉瘤形成的实验研究

我们建立大鼠腹主动脉瘤 (AAA)模型 ,通过局部缓释反义寡脱氧核苷酸的方法封闭胞间粘附分子 (ICAM ) 1基因表达 ,观察动脉瘤形成过程的改变 ,以进一步研究AAA的发病机制及防治措施。材料与方法1.实验动物分组及AAA模型建立 :Wistar大鼠 6 4只 ,体重 2 5 0～ 30 0 g ,随机分组 :(1)对照组 2 4只 ,分为正常动脉组、术后 3d、7d、14d组 ;(2 )Lipofectin组 6只 ;(3)寡脱氧核苷酸 (ODNs)组 36只 ,分为反义组、正义组和错配组 ,再分为5 0 μg和 2 0 0 μg组。按文献 [1]制成AAA模型。寡核苷酸组以Lipofectin(GIBCO BRL)作为携带系统 …     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制作用

目的　探讨乙酰肝素酶 (HPSE)反义寡脱氧核苷酸 (AS ODN )对人乳腺癌细胞株侵袭力的抑制活性。方法　设计合成分别互补于HPSEmRNA 5 '未翻译区和起始密码区的AS ODN1、AS ODN2及相应对照NS ODN1、NS ODN 2 ,在脂质体介导下以 2 5 0nmol/L终浓度转染人乳腺癌MDA43 5细胞 ,以RT PCR和Westernblot分别检测HPSEmRNA和蛋白表达 ,以基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力。结果　AS ODN 2组的HPSEmRNA相对表达量、蛋白表达量和侵袭细胞数(0 .62± 0 .0 4、12 .70± 1.70、61.0 0± 9.0 0 )与脂质体对照组 (1.60± 0 .0 4、3 6.2 0± 2 .10、178.0 0±17.0 0 )和NS ODN2组 (1.48± 0 .0 3、3 5 .5 0± 2 .3 0、174.0 0± 2 0 .0 0 )相比较均显著降低 (P <0 .0 1) ;而AS ODN 1组与脂质体对照组和NS ODN1组相比较差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　互补于起始密码区的HPSEAS ODN可通过下调HPSE表达显著抑制人乳腺癌细胞株MDA43 5的侵袭力。     

疏肝理气活血法对肝郁气滞大鼠阴茎海绵体PDE5活性影响的实验研究

目的 :探求肝郁气滞阴茎海绵体组织中Ⅴ型磷酸二酯酶 (PDE5 )活性及疏肝理气活血中药对其影响。　方法 :采用与人类精神性应激十分相似的非损伤性应激刺激法 ,制造肝郁气滞型SD大鼠动物模型 4 0只 ,随机法将大鼠分为 :空白组 ;肝郁证造模组 (简称模型组 ) ;萎康凝胶高剂量给药组 (高剂量组 )和低剂量给药组 (低剂量组 ) 4组 ,每组 10只。以免疫组化与计算机图像分析技术测定海绵体组织中PDE5活性。　结果 :高剂量组阴茎海绵体组织中PDE5活性与模型组差异有显著性 (P <0 .0 1)。　结论 :肝郁气滞可导致阴茎海绵体组织中PDE5活性增强 ,而疏肝理气活血中药有抑制PDE5活性的作用     

Smac/DIABLO反义寡脱氧核苷酸抑制过氧化氢所致心肌细胞凋亡的实验研究

目的观察Smac/DIABLO反义寡脱氧核苷酸(asODN)对H_2O_2引起的大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法将原代培养的新生Wistar大鼠心肌细胞随机分为正常对照组(不行转染)、对照组(单纯用脂质体处理)、错义寡脱氧核苷酸(scrODN)组(转染Smac/DIABLO scrODN)、asODN组(转染Smac/DIABLO asODN)、H_2O_2组(仅受H_2O_2刺激)、scrODN+H_2O_2组(同scrODN组处理后受H_2O_2刺激)、asODN+H_2O_2组(同asODN组处理后受H2O_2刺激),Smac/DIABLO scrODN或asODN浓度均为4μmoL/L,H_2O_2为0．5 mmol/L。采用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法观察Smac/DIABLO mRNA和蛋白质表达水平的变化；采用hoechst 33258荧光染色,计算凋亡核百分率；抽提DNA行琼脂糖凝胶电泳,观察是否出现DNA“梯状”条带；采用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)活性检测试剂盒观察caspase-3、caspase-9的活化情况。结果asODN组细胞Smac/DIABLO mRNA的表达明显受抑制,其蛋白质水平较正常对照组下降约80%；对照组、scrODN组、正常对照组此2项指标相近(P＞0．05)。正常对照组、scrODN组及asODN组凋亡核百分率低,且caspase-3、caspase-9的活性也处于低表达水平。H_2O_2组、scrODN+H_2O_2组凋亡核百分率分别为(52±3)%、(55±5)%,均见典型DNA“梯状”条带,caspase-3、caspase-9活性均明显高于正常对照组(P＜0．01)；asODN+H_2O_2组凋亡核百分率降至(19±5)%,且caspase-3、caspase-9活性明显低于scrODN+H_2O_2组(P＜0．01),DNA“梯状”条带亦明显减少。结论Smac/DIABLO asODN能抑制H_2O_2所致大鼠心肌细胞的凋亡。     

siRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶表达的抑制作用

目的观察小干扰RNA(siRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶(PDE5)表达的抑制作用,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法使用美国Ambion公司提供的设计软件设计人PDE5基因的siRNA序列,并合成3对PDE5siRNA和1对阴性对照siR-NA,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。RT-PCR法半定量检测siRNA对PDE5mRNA表达的抑制作用;Westernblot法检测海绵体平滑肌细胞PDE5蛋白表达水平。结果siRNA1、siRNA2和siRNA3转染后人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5mRNA表达分别下降58.2%、14.9%和11.9%;PDE5蛋白表达量下降约70.5%、19.8%和17.3%;阴性对照siRNA组未引起PDE5mRNA和蛋白表达的变化。结论体外化学合成的PDE5siRNA能特异有效地下调PDE5基因表达,不同序列特异性的siRNA下调PDE5基因表达的能力不同,为ED的基因治疗提供了新思路。     

阴蒂海绵体中磷酸二酯酶5表达及淫羊藿甙对cGMP浓度的影响

目的　探讨阴蒂海绵体中磷酸二酯酶 5表达及淫羊藿甙对cGMP浓度的影响。　方法　通过反转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)检测兔阴蒂海绵体中PDE5mRNA的表达 ;12 5I放射免疫法测定不同浓度淫羊藿甙对阴蒂海绵体内PDE5酶底物cGMP浓度的影响 ,西地那非作为阳性对照 ,分别计算EC50 。　结果　阴蒂海绵体组织中有PDE5的表达 ,淫羊藿甙可明显提高阴蒂海绵体内的cGMP浓度 ,具有显著的浓度依赖性。　结论　淫羊藿甙对阴蒂海绵体平滑肌细胞内cGMP水平的影响可能是通过PDE5发挥作用 ,与NO cGMP信号通路有关。     

5型磷酸二酯酶抑制剂对前列腺癌的影响

随着越来越多局限性前列腺癌患者选择行根治性前列腺切除术,术后勃起功能障碍作为一种常见的并发症也越来越被患者及泌尿外科医师重视.5型磷酸二酯酶抑制剂目前已被广泛应用于前列腺癌根治术后勃起功能的治疗,其疗效和安全性也已经被越来越多的临床研究所证实.现有的基础研究对5型磷酸二酯酶抑制剂在肿瘤细胞的发生和进展中的作用尚需进一步证实.临床研究虽然证实该类药物并不会增加前列腺癌的发病风险,但该类药物的使用是否增加前列腺癌术后生化复发的风险目前意见尚不统一.本文就5型磷酸二酯酶抑制剂与肿瘤发生可能相关的作用机制和对前列腺癌的发病以及前列腺癌根治术后生化复发的影响进行综述.     

人阴茎海绵体平滑肌细胞的原代培养及鉴定

目的　为研究人阴茎勃起功能提供方便的实验材料。　方法　取新鲜尸体阴茎海绵体平滑肌细胞 ,用含 2 0 %人AB型血清的DMEM液作体外原代培养 ,并以免疫组化法鉴定。　结果　经 10～ 14d培养后 ,6个培养瓶内均铺满梭状细胞 ,免疫组化法鉴定确认为人阴茎海绵体平滑肌细胞。　结论　人阴茎海绵体平滑肌细胞可在体外条件下生长传代 ,并可能成系 ,为阴茎勃起功能的研究提供方便的材料     

人阴茎海绵体平滑肌细胞三维培养模型的建立

目的 观察人阴茎海绵体平滑肌细胞(hCCMCs)在三维培养系统中的生物学特性.方法 体外分离hCCMCs,并用差速贴壁法进行纯化.免疫组化的方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,进行hCCMCs的鉴定.在单层贴壁培养的基础上,将hCCMCs在胶原凝胶中培养,形成三维培养系统,并对hCCMCs的形态结构、增殖情况进行研究.结果 原代培养的hCCMCs细胞形态不均一,经过差速贴壁法纯化后,细胞形态均一,免疫组化显示大多数细胞α-SMA阳性表达.三维培养系统中,hCCMCs在不同层面上呈三维生长.hCCMCs在三维培养系统中培养10d后,细胞数量无明显增殖(P>O.05),明显低于贴壁培养条件下细胞增殖速率(P<0.01).结论 hCCMCs三维培养系统可以观察hCCMCs在三维条件下的生长、增殖状况,研究hCCMCs与微环境的相互作用关系,有望为相关研究找到一种更为简单、可控性更强的体内实验替代方法.     

红景天苷对低氧诱导大鼠海绵体平滑肌细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨红景天苷对低氧诱导的大鼠海绵体平滑肌细胞(CCSMCs)凋亡的影响。方法:采用酶消化法体外培养大鼠CCSMCs,抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定CCSMCs纯度;通过MTT法筛选红景天苷无毒剂量;以低氧混合气体(1%O2,5%CO2,94%N2)通入缺氧小室建立细胞低氧模型;细胞分为3组:正常组,低氧组,红景天苷(32μg/ml)干预组,采用流式细胞术观察各组CCSMCs凋亡的情况,Western印迹检测caspase-3蛋白表达水平。结果:成功培养大鼠CCSMCs,免疫荧光显示绝大部分细胞α-SMA、Desmin阳性;≤32μg/ml的红景天苷对细胞无明显的毒性;低氧组CCSMCs早期凋亡[(18.69±1.29)%]较正常组[(12.77±1.41)%]明显增多(P0.01),低氧组晚期凋亡[(21.03±1.53)%]较正常组[(14.63±2.00)%]亦增加(P0.05),同时,活化型caspase-3蛋白表达上升(P0.01);32μg/ml红景天苷剂量下可有效降低低氧诱导的CCSMCs早期凋亡率[(13.46 1.87)%](P0.01),活化型caspase-3蛋白表达下降(P0.01)。结论:红景天苷能够降低低氧诱导的CCSMCs活化型caspase-3蛋白的表达,抑制了低氧诱导的CCSMCs凋亡。     

Diabetic nephropathy: Treatment with phosphodiesterase type 5 inhibitors

The importance of nitric oxide (NO) in vascular physiology is irrefutable; it stimulates the intracellular production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), initiating vascular smooth muscle relaxation. This biochemical process increases the diameter of small arteries, regulating blood flow distribution between arterioles and the microvasculature. The kidney is no exception, since NO predominantly dilates the glomerular afferent arterioles. It is now evident that the vascular production of cGMP can be augmented by inhibitors of phosphodiesterase type 5 (PDE 5), the enzyme which breakdowns this cyclic nucleotide. This has clinical relevance, since diabetic nephropathy (DN) a major microvascular complication of diabetes mellitus and the most common cause of end-stage renal disease, increases intraglomerular capillary pressure, leading to glomerular hypertension. PDE 5 inhibitors may have, therefore, the potential to reduce glomerular hypertension. This review describes the use of PDE 5 inhibitors to improve the metabolic, haemodynamic and inflammatory pathways/responses, all of which are dysfunctional in DN.     

Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isoenzymes in the human detrusor smooth muscle

Phosphodiesterases (PDEs) are key enzymes involved in the regulation of intracellular cyclic nucleotide metabolism. The aim of the present study was to identify and to characterize the PDE isoenzymes present in the human detrusor smooth muscle. Human detrusor PDE isoenzymes were separated by Q-Sepharose anion exchange and calmodulin-agarose affinity chromatography and characterized upon their kinetic characteristics and their sensitivity to allosteric modulators and inhibitors. All five presently known PDE isoenzyme families were identified: one high-affinity, low-K _m calcium/calmodulin-stimulated PDE I with a slight preference for cGMP over cAMP, one cGMP-stimulated PDE II, one cGMP-inhibited PDE III, one cAMP-specific PDE IV and one cGMP-specific PDE IV. All five known PDE isoenzyme families exist in human detrusor smooth musculature. The kinetic characteristics, together with functional in vitro studies, suggest that the PDE I may be of importance in the intracellular regulation of the human detrusor smooth muscle tone.     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的快速分离及鉴定

目的探讨兔阴茎海绵体平滑肌细胞快速分离方法,为应用膜片钳技术研究阴茎勃起机制提供实验材料.方法采用木瓜蛋白酶和胶原酶两步酶解消化法,快速分离出新西兰大白兔阴茎海绵体平滑肌细胞并应用免疫组化鉴定.结果分离的细胞成活率较高,贴壁呈长梭形,胞膜光滑完整,胞浆均匀,可用于膜片钳记录.免疫组化鉴定为兔阴茎海绵体平滑肌细胞.结论酶解消化快速分离兔阴茎海綿体平滑肌细胞为全细胞膜片钳技术研究阴茎勃起功能障碍的电生理机制提供了较好的实验材料.