人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人TRAIL基因，构建其原核表达载体。方法 采用RT-PCR（方法从人宫颈癌细胞系HeLa的总RNA中扩增TRAIL基因114～281片段的cDNA，并将目的片段克隆至原核表达载体pET32a（＋）。结果 克隆到人TRAIL基因114～281片段的cDNA，DNA测序结果与GenBank基因库报导的完全一致，经SDS～PAGE电泳。可见29kD大小的融合蛋白质表达。结论 人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达。为进行研究sTRAIL的作用机制提供了实验依据。     

人TRAIL胞外区原核可溶性表达及活性鉴定

目的获得具有生物活性的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)胞外段蛋白。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性要求,设计合成编码TRAIL胞外段的DNA序列,构建成pET30a-TRAIL胞内融合表达质粒,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21。在不同温度、不同浓度的IPTG条件下诱导表达TRAIL,SDS-PAGE分析表达产物,MTT法检测产物活性。结果构建的工程菌株表达29KD的可溶性TRAIL融合蛋白,能诱导Jurkat细胞凋亡。结论成功表达了人TRAIL胞外段蛋白,为进一步研究提供基础。     

人可溶性TRAIL cDNA的克隆及新型原核表达载体的构建

目的 克隆人可溶性TRAIL（sTRAIL)cDNA并构建其原核表达载体，为制备新型抗癌分子创造条件。方法 提取HL－60细胞总RNA，经RT－PCR扩增编码人TRAIL114－281氨基酸残基的cDNA序列，将其克隆至pUC19进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT－PCR扩增得到了504bp的DNA片段，序列分析表明与GeneBank中报道的编码人TRAIL 114－281氨基酸残基的cDNA序列安全一致。结论 sTRAIL cDNA的克隆及其原核表达载体的构建，为进一步制备具有抗肿瘤活性的sTRAIL奠定了基础。     

人可溶性TRAIL蛋白表达及纯化条件优化

目的：优化人可溶性TRAIL蛋白生产菌发酵及纯化条件,从而提高TRAIL的产量及活性。方法①探索6种不同培养液、培养液pH值、异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导浓度及时间,选择最佳发酵条件;②联合镍离子亲和层析及超滤法纯化人可溶性TRAIL蛋白。结果①人可溶性TRAIL的最佳发酵条件为pH7．4的YPD培养液,所用IPTG的最佳浓度为0．2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h;②经镍离子亲和层析和超滤联合作用可得纯度极高的蛋白。结论成功完成了人可溶性TRAIL发酵及纯化条件的优化,为今后大量提取TRAIL蛋白奠定了基础。     

人可溶性TRAIL原核表达载体的构建和蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的建立高效表达可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白的原核表达载体,获得高生物学活性的TRAIL蛋白。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pET30a中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。重组载体转化感受态细胞BL21,优化蛋白表达条件;亲和层析法纯化重组蛋白;SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot鉴定。重组蛋白与TRAIL蛋白标准品分别作用Huh-7细胞,CCK8、流式细胞术检测蛋白生物学作用。结果 DNA测序结果证实成功构建重组质粒pET30a/TRAIL,SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot显示pET30a/TRAIL诱导的为可溶性的His-rTRAIL。CCK8、流式细胞术检测结果显示,与TRAIL蛋白标准品相比,His-rTRAIL对Huh-7细胞具有良好的促凋亡作用。结论成功构建高效表达可溶性TRAIL蛋白的原核表达载体pET30a/TRAIL,表达的可溶性蛋白His-rTRAIL具有高度的生物学作用,为肿瘤的生物学治疗提供新的实验依据。     

人可溶性CD40L cDNA的克隆及表达

目的: 利用基因技术克隆CD40L分子的胞外区184～831片断cDNA,构建其原核表达载体,从而建立原核表达体系. 方法: 采用RT-PCR 方法从人扁桃体的总RNA中扩增CD40L分子184～831片断的cDNA,以限制性酶切和DNA 测序进行鉴定,并将目的片断克隆至原核表达载体pET-28a ,让重组质粒在BL21中表达,利用Western blot鉴定目的蛋白. 结果: 克隆到人sCD40L分子184～831片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致;构建了该片断的原核表达载体, 且目的蛋白能在BL21中表达. 结论: 成功克隆人sCD40L分子184～831片断的cDNA并构建了其原核表达载体. 在BL21中成功表达了目的蛋白.     

靶向克隆法构建NY-ESO-1基因的原核表达载体

目的:利用PCR产物靶向克隆法构建人癌-睾丸抗原NY-ESO-1的原核表达载体。方法:从人新鲜的食管癌组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增NY-ES0-1基因3′端的340bp片段,采用靶向克隆法将目的基因插入到原核表达载体pET-15b中,得到重组表达质粒pET-15b-NY-ESO-1,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物核苷酸序列分析等,鉴定所构建的原核表达载体。结果:扩增得到NY-ESO-1基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR,酶切鉴定获得了一个大小为340bp的特征性片段,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因NY-ESO-1。结论:靶向克隆法可快速、高效地构建人NY-ESO-1基因的原核表达载体,为制备pET-15b-NY-ESO-1融合蛋白奠定了基础。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的 克隆及原核表达西藏小型猪瘦素(Leptin)成熟肽及瘦素受体胞外区片段.方法 根据西藏小型猪瘦素序列(GenBank号:GQ240885.1)和猪瘦素受体基因胞外域序列(GenBank号:AF167719.1)分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得了特异性片段.再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanH Ⅰ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位(成熟肽编码区)和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD<,18>-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存.此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamH Ⅰ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物.结果 在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×10<'3>左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×10<'3>左右的融合蛋白.结论 说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21(DE3)中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础.     

TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究

目的 利用蛋白自剪切功能原核表达系统构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白表达载体,并进行表达条件优化和初步纯化。方法 设计基因拼接引物,合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体pTWIN1相连接,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子。将鉴定（酶切及序列分析）阳性的重组子质粒转人大肠埃希菌ER2566表达菌中,采用蛋白质SDS—PAGE电泳方法分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白表达情况。结果 成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列,酶切及序列分析证实成功构建了TRAIL胞膜外段蛋白自剪切功能原核表达载体。采用0．3mmol／LIPTG、15℃诱导过夜（14～16h）,目的蛋白获得较高表达量,且大部分为可溶性蛋白。结论 采用大肠埃希氏菌ER2566,TRAIL胞膜外段融合蛋白获得高表达,经简单后续处理即可获得不含任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白。     

人膜联蛋白Ⅴ基因的克隆及原核表达

目的构建人膜联蛋白ⅤcDNA的原核表达载体并诱导其表达。方法利用RT-PCR技术从人胎盘组织总RNA扩增膜联蛋白Ⅴ基因的编码序列,将扩增产物克隆至GST融合表达载体pGEX-2T,以IPTG诱导GST融合人膜联蛋白Ⅴ的表达。结果凝胶电泳显示人胎盘组织PCR扩增产物的分子质量大小与目的片段大小相符。对重组质粒分析表明,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白Ⅴ基因编码序列一致。在IPTG的诱导下,BL21重组菌高效表达出一个相对分子质量约为60000的产物。结论人膜联蛋白Ⅴ编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

应用RT—PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm—T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

人白细胞介素10的克隆及分泌表达

目的：研究人白细胞介素10（hIL-10)的高效分泌表达。方法：根据Genbank报道的hIL-10基因序列，人工合成hIL-10基因，并将某些稀有密码子替换成E.Coli偏爱密码子，克隆至pUC18质粒中，测序结果与预期一致，将hIL-10基因克隆至PET22b，构建分泌表达克隆PET22b-hIL-10，经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）中表达hIL-10天然蛋白。结果：SDS－PGAE电泳及凝胶密度扫描分析显示，重组蛋白分子量约为18KD和21KD(含信号肽），不同温度条件下重组蛋白的表达状态和表达量不同，结论：18摄氏度重组蛋白hIL-10的表达量为7．6％。     

人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建

目的：克隆人转化生长因子-β1（TGF-β1）基因编码区cDNA序列，构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。方法：设计含有EcoRI和Xhol Ⅰ酶切位点的TGF-β1 cDNA引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，以人白细胞mRNA为模版，扩增TGF-β1基因，纯化PCR产物，TA克隆，双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，酶切鉴定阳性董组子，并进行序列测定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示，用双酶切后形成分子量1．2kb的条带，符合物理图谱，表明表达载体构建成功，序列测定结果与预测结果完全一致。结论：成功克隆了TGF-β1基因，并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.     

Migfilin基因的克隆和真核表达载体的构建

目的 克隆Migfilin全长cDNA,构建Flag-migfilin真核表达载体并进行序列测定,为研究migfilin与疾病的关系奠定基础.方法 根据人全长migfilin cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板,利用PCR技术克隆migfilin全长cDNA.将扩增出的目的基因克隆至pCR 2.1载体,经Xba I/Hind Ⅲ双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA序列测定.将测序正确的目的基因克隆至Flag载体并鉴定.结果 成功克隆了migfi-lin全长cDNA,序列测定表明与已知migfilin基因序列一致.在此基础上,构建了flag-migfilin真核表达载体并进行了鉴定.结论 Flag-migfilin真核表达载体构建成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

CTLA—4在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 在原核表达系统大肠杆菌中表达具有生物活性的人毒性T淋巴细胞相关蛋白－4可溶性部分（human soluble CTLA-4)。方法 PCR扩增获得CTLA－4编码基因,利用表达载体pGEX－2T构建重组质粒2TC,在所获DNA片段与文献报道CTLA－4序列一致。在重组大肠杆菌中0．10mmol/L IPTG诱导4h可大量生成相对分子质量40000的GST－CTLA4融合蛋白。Westen blot分析表明原核表达产物CTLA－4具抗原抗体结合活性。结论 hsCTLA－4可在原核表达系统中表达并具有免疫活性。     

人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人白细胞介素7（hIL-7）的真核表达载体。方法：从人脾脏组织的总RNA中，用RT－PCR方法扩增出编码成熟hIL-7的cDNA，将其克隆于pMD18-T质粒中，并进行序列测定。再将hIL-7cDNA以正义及反义插入真核、原核双重表达载体pBK-CMV质粒，转化至大肠杆菌DH5α。最后将表达的lacz-hIL-7重组蛋白行SDS－PAGE电泳，并作考马斯亮蓝染色分析，western blot鉴定。结果：hIL-7序列测定结果与预期一致。pBK-CMV-hIL-7（正义插入）的无隆表达重组蛋白，western blot证实此蛋白为IL－7。结论：成功构建了hIL-7的真核表达载体，为进一步研究hIL-7的抗肿瘤作用创造了条件。     

Gene cloning of murine α-fetoprotein gene and construction of its eukaryotic expression vector and expression in CHO cells

Summary To clone the murine α-fetoprotein (AFP) gene, construct the eukaryotic expression vector of AFP and express in CHO cells, total RNA were extracted from Hepa 1–6 cells, and then the murine α-fetoprotein gene was amplified by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1. The recombinant of vector was identified by restriction enzyme analysis and sequencing. After transient transfection of CHO cells with the vector, Western blotting was used to detect the expression of AFP. It is concluded that the 1.8 kb murine α-fetoprotein gene was successfully cloned and its eukaryotic expression vector was successfully constructed. YI Jilin, male, born in 1953, Professor