MEA治疗难治性白血病及其核基质的变化研究

探索了用米托蒽醌、VP-16、阿糖胞苷联合化疗治疗难治性急性淋巴细胞白血病及其前后细胞核基质蛋白的变化.结果三药联用的有效率为66.7%,明显高于对照组.说明米托蒽醌、VP-16、阿糖胞苷联合化疗对治疗难治性急性淋巴细胞白血病有效,核基质是某些抗癌药物的作用点,分子量为180KD的核基质蛋白缺失可能与细胞耐药性有关.     

PML-RARα245与hGM-CSF双基因DNA疫苗的构建与表达

目的 采用长度为245 bp的急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因片段构建新的PML-RARα与hGM-CSF真核双表达载体.方法 用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增长度为245 bp的PML-RARα基因片段,PCR技术从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点A和B中,构建真核双表达载体.用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性.将重组质粒转染K562细胞,利用RT-PCR和点杂交技术检测重组质粒在真核细胞中的转录和翻译情况.结果 双酶切结果证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列完全正确.该重组质粒能够在真核细胞中正常转录和翻译.结论 成功构建了含有PML-RARα245及hGM-CSF的双表达载体,为筛选合适的抗原片段用于构建治疗急性早幼粒细胞白血病的PML-RARαDNA疫苗提供重要资料.     

白血病患者p16基因失活机制研究

目的了解白血病患者p16基因纯合性缺失、点突变及启动子区甲基化状态,探讨白血病发生中p16基因失活机制。方法采用聚合酶链反应、聚合酶链反应-单链构象多态性以及巢式甲基化特异性PCR法,对57例白血病患者进行p16基因纯合性缺失、点突变及启动子区甲基化状态研究。结果在受检的57例白血病患者中,共有6例发生p16基因纯合性缺失（10.53%）;无p16第1、2外显子缺失的51例白血病患者中均未见点突变发生;无p16基因第1、2外显子缺失、突变的51例白血病患者中共有16例发生p16基因甲基化（31.37%）,其中14例（27.45%）发生在急性白血病患者;57例白血病患者中共有22例发生p16基因失活（38.60%）。结论白血病发生过程中表观遗传学机制和遗传学机制相互作用,p16基因启动子区高甲基化可能是急性白血病发生中p16基因失活的主要机制。     

肝豆状核变性患者ATP 7B基因外显子8、12、18的DNA测序突变

目的 对肝豆状核变性(WD)患者ATP7B基因外显子(exon)8、12、18进行PCR扩增测序,研究其突变特点.方法 对30例患者(WD组)和10例健康者(对照组)提取外周血基因组DNA,PCR扩增ATP7B基因外显子8、12、18相关片段,并对扩增产物进行测序和分析测序结果 .结果 对照组未见异常,WD组发现12例患者外显子8有突变,突变率为40.0%,测序发现有6例患者外显子Arg778leu呈复合杂合子突变;发现4例外显子12有突变,有2例患者存在双重突变,外显子18未检出突变.结论 WD的ATP7B基因外显子8、12为突变的热点区,18号外显子不是突变热点.     

MEA治疗难治性白血病及其核基质的变化研究

探索了用来托蒽醌、ＶＰ－１６、阿糖胞苷联合化疗治疗难治性急性淋巴细胞白血病及其前在质蛋白的变化。结果三药联用的有效率为６６．７％，明显高于对照组。说明米托蒽醌、ＶＰ－１６、阿糖胞苷联合化疗对治疗难治性急性淋巴细胞白血病有效，核基南是某些抗癌药物的作用点，分子量为１８０ＫＤ的核基质蛋白缺失可能与细胞耐药性有关。     

p16和p15第二外显子HapⅡ位点在成人急性髓性白血病中的突变

目的　探讨p16和p15基因第二外显子HapⅡ位点在成人急性髓性白血病 (AML)中的突变。方法　用甲基敏感和甲基非敏感限制性内切酶切消化基因组DNA后 ,经PCR扩增和琼脂糖电泳研究 3 1例AML中无p16/p15基因第二外显子缺失的患者中HapⅡ位点的突变情况。结果　在 3 1例成人AML样本中 ,p16E2 的 4个HapⅡ位点和p15E2 的 6个HapⅡ位点均未发生突变。结论　本研究提示p16和p15基因第二外显子中因甲基化而引起的CCGG位点的突变在成人AML患者中不是主要失活方式。     

白杨素和它的四乙基二磷酸酯对人宫颈癌 Hela细胞增殖和核基质蛋白影响的研究

探讨白杨素和它的四乙基二磷酸酯对人宫颈癌细胞的增殖、分化和核基质蛋白的影响。用终浓度为10μmol/L的白杨素(chrysin,CR)和四乙基白杨素二磷酸酯(tetraethyl bis-phosphoric ester of chrysin,CP)分别处理人人宫颈癌Hela细胞,记录细胞生长数目,进行增殖分化型细胞染色,测定软琼脂集落形成率,应用SDS-PAGE技术分析细胞核基质蛋白成分的变化。CR/CP能明显抑制Hela细胞的增殖,处理组与对照组之间差异有显著性(P<0.05);处理组与对照组比较增殖型细胞减少,分化型细胞数增加,双层软琼脂中细胞集落形成受到明显抑制,对照组集落普遍比药物组集落大,且单个集落中细胞数目多(P<0.05);通过Quantity One软件分析,实验组(CR组与CP组)与对照组(C组)比较,相对分子质量70 0006、8 000、13 000为增加的条带,14 000、17 000、18 000为增强的条带,58 000、43 000是减弱的条带。两实验组相比,以CP组变化显著。CR和CP对Hela细胞具有增殖抑制和诱导分化作用。同时还可以诱导Hela细胞核基质蛋白成分改变,这可能对肿瘤细胞基因表达调控、分化及凋亡起重要作用。     

环磷酰胺诱导永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中的基因突变

环磷酰胺 (CP)是国际癌症研究署确认的人类I组致癌原 ,目前缺乏适宜的人类细胞模型开展致癌相关的细胞和分子机理的研究 .本室已经进行了CP诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)恶性转化的工作 ,建立了CP的癌前转化细胞 (BEAS CP) ,以此为细胞模型 ,本实验运用聚合酶链式反应单链构象多态性和序列分析的方法进行了细胞转化进程中基因突变的动态分析 .分别关注了p5 3基因第5～ 8,p16基因第 1～ 2和ki ras基因第 1外显子的突变情况 .研究结果表明 :BEAS CP细胞存在p16基因第 1外显子多位点和ras基因第 1外显子单位点的碱基突变 ,晚代龄的转化细胞没有测到p5 3基因的突变 .综上实验结果认为 :p16基因突变可能与BEAS CP细胞周期的增殖性改变有关 ,ki ras基因的突变则可能具有转化启动效应 ,两者都是细胞转化过程中的重要分子事件     

儿童急性白血病bcl-2、p16蛋白的表达及病理意义

目的研究初诊儿童急性白血病bcl-2、p16蛋白的表达及两者关系,探讨细胞凋亡和细胞增殖在急性白血病发生中的作用。方法采用免疫组化技术检测bcl-2和p16蛋白在29例初诊急性白血病患儿骨髓活检组织中的表达,并与19例非白血病患儿的表达作对照。结果实验组bcl-2蛋白表达显著高于对照组;实验组p16蛋白表达显著低于对照组;在儿童初诊急性白血病中p16与bcl-2表达呈负相关。结论bcl-2过度表达引起的细胞凋亡抑制增强和p16失表达引起的细胞增殖抑制减弱在急性白血病发生发展中发挥重要作用;细胞凋亡障碍和细胞增殖失控在多数白血病发病中可能存在某种协同作用,细胞凋亡抑制在部分白血病的发病中可能比细胞增殖失控起的作用更重要。     

Thienamycin环化酶基因的结构及在大肠杆菌中表达的研究

对来自重组质粒ｐ６ＢＣ１２外源片段上的１．３ｋｂ片段进行核苷酸序列分析，结果表明整个片段的Ｇ＋Ｃ含量为６８．６％，基因结构符合链霉菌基因特点，其上存在一个完整的开放阅读框架（ＯＲＦ），由４０５个碱基组成，编码１３４个氨基酸，起始密码为ＡＴＧ，终止密码为ＴＧＡ，起始密码上游有保守的ＳＤ序列ＧＧＡＧＧ。推测的－１０区为ＣＡＧＣＣＴ，－３５区为ＴＴＧＣＡＧ。终止密码下游有一个长为１８ｂｐ的反转重复序列。根据基因定位的结果，认为是ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因。它与异青霉素Ｎ合成酶基因连锁。与Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ中异青霉素Ｎ合成酶及克拉维胺酸合成酶相比氨基酸序列的同源性极低，表明这可能是一个新的基因。利用ＰＣＲ技术将环化酶基因扩增并克隆至大肠杆菌高表达载体ｐＴ７－７，使其在大肠杆菌中得到表达，同位素参入实验结果表明蛋白分子量为１４．５ｋＤ，与理论值相符。表达产物在体外可分别将纯化的ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ环化酶基因阻断变株Ｙ３的中间产物和Ｙ３发酵液转化为具抗菌活性物质。     

Capillary electrophoresis study on DNA-protein complex formation in the polymorphic 5' upstream region of the dopamine D4 receptor (DRD4) gene

DNA-protein interaction in the 5' upstream polymorphic region of the dopamine D4 receptor (DRD4) gene was analyzed by capillary electrophoretic mobility shift assay (CEMSA). The sequence of interest was amplified using a fluorescent primer and applied as a probe in the binding assays with HeLa nuclear extract. Serial dilution of the probe resulted in a concentration dependent DNA-protein complex formation. Sp 1 specific oligonucleotide competitor significantly inhibited the DNA-protein complex formation. A non-specific competitor, differing only in three base pairs, showed weaker effect pointing to the contribution of the Sp 1 recognition sequence in the complex. Polymorphic competitors were also prepared from homozygous individuals possessing either duplicated (2 x 120 bp) or single copy (1 x 120 bp) of the 120 bp repeat sequence and were used against the Sp 1 specific probe in competition assays. Our data provide experimental evidence for the binding of Sp 1 to the 120 bp duplicated sequence of the DRD4 5' upstream region and suggest enhanced binding capacity of the duplicated form.     

AT islands - their nature and potential for anticancer strategies

The human genome contains a unique class of domains, referred to as AT islands, which consist typically of 200-1000 bp long tracts of up to 100% A/T DNA. The significance of AT islands as potential targets for chemotherapeutic intervention stems from two main aspects. First, AT islands are inherently unstable (expandable) minisatellites that are found in various known loci of genomic instability, such as AT-rich fragile sites. Second, AT islands are involved in the organization of the genomic DNA on the nuclear matrix by acting as scaffold/matrix attachment regions, S/MARs. DNA duplexes of AT islands are unusually flexible and prone to base unpairing, which are crucial MAR attributes. Various AT islands show high binding affinity for isolated nuclear matrices and associate with the nuclear matrix in the cell. The cellular MAR function of AT islands may differ in cancer and normal cells. The abnormally expanded AT islands in the FRA16B fragile site in leukemic CEM cells act as strong, permanent MARs, while their unexpanded counterparts in normal cells are loop localized. Given their instability and involvement in the remodeling of the nuclear architecture, AT islands may be a factor in cancerous phenotypes. AT islands are preferentially targeted by the extremely potent DNA-alkylating antitumor drugs, bizelesin and U78779. High lethality of lesions in AT islands is consistent with the critical role of MAR domains in DNA replication. The abnormal structure/function of AT islands, such as their expansion and acquired strong MAR properties, may sensitize cancer cells to AT island targeting drugs.