基于细胞膜色谱法的新疆准噶尔乌头中抗EGFR活性成分筛选

摘 要 目的：从准噶尔乌头中筛选抗EGFR作用的活性成分,并考察筛选成分对HEK293细胞和EGFR/HEK293高表达细胞株的抑制活性。方法: 用高表达表皮生长因子受体细胞膜色谱（EGFR/CMC）通过十通切换阀与高效液相色谱（HPLC）构成二维在线联用色谱系统,将CMC上保留的组分进行接液,用离线MS来鉴定准噶尔乌头中抗EGFR活性成分;利用分子模拟对接实验分析活性成分与受体的相互作用方式;体外用MTT实验证实活性组分对 HEK293细胞和EGFR/HEK293高表达细胞株的抑制作用。结果:乌头碱、12 表 欧乌碱、准噶尔乌头碱为作用于EGFR的有效成分,并具有与对照药物吉非替尼类似的色谱保留特性;分子模拟对接实验表明这些成分与EGFR的相互作用方式与阳性药吉非替尼相似;MTT实验证实在浓度为0.4～50 μmol·L-1范围内乌头碱,12 表 欧乌碱,准噶尔乌头碱对HEK293细胞增殖与EGFR高表达的体外抑制作用具有剂量依赖性。结论:筛选的结果与生物效应相一致;在线EGFR/CMC HPLC MS二维色谱系统在中药复杂体系中快速筛选发现活性物和药物先导物方面具有良好的应用前景,同时充分展现了细胞膜色谱法操作简便,快速,高效灵敏的优势。     

HEK293α1A、HEK293α1B细胞膜色谱系统的构建及其与配体的细胞膜色谱研究

目的：作为一种新型生物亲和色谱技术，细胞膜色谱（Cell membrane chromatography，CMC）始创于1996年。细胞膜固定相（The cell membrane stationary phase，CMSP）由多孔硅胶包被生物活性细胞膜组成。本研究了细胞膜色谱系统中受体和配体之间的相互作用，尤其是评价了细胞膜色谱法用于亚型受体研究的精确性和可行性。提供受体高表达HEK293α1A、HEK293α1B。细胞膜色谱系统和技术路线，为肾上腺素受体亚型高选择性配体的研究提供新的方法。     

细胞膜色谱-中药复杂体系的新药发现

1．细胞膜色谱（Cell Membrane Chromatography,CMC）CMC实质上是一种新型的具有生物活性的亲和色谱系统。首先，通过膜制备，将细胞膜固定于活化的硅胶载体表面，制成的细胞膜固定相（cellmembrane stationary phase，CMSP），然后溶解有化合物的流动相进入CMSP，根据候选化合物溶液（流动相）在CMSP内保留特性（容量因子κ’），     

细胞膜色谱技术应用于中药活性成分筛选的研究进展

目的了解细胞膜色谱技术在中药活性成分筛选应用中的研究进展,为该技术的进一步开发和应用提供参考。方法通过查阅国内外相关文献,进行总结、分析,对细胞膜色谱技术在中药活性成分筛选中的应用进行综述。结果细胞膜色谱技术已成功应用于中药药效物质基础研究,对于中药活性成分的筛选涉及到多个方面,包括抗炎镇痛、抗心血管疾病、抗糖尿病和抗肿瘤等活性成分,并在不断发展和完善。结论细胞膜色谱技术还存在一些问题,随着对该技术研究的不断深入,其在中药药效物质基础研究等方面具有广阔的前景。     

传统中药中抗动脉粥样硬化PPARα激动剂的虚拟筛选

目的基于传统中药寻找抗动脉粥样硬化的先导药物分子。方法过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)是抗动脉粥样硬化的研究热点之一,以该受体为靶标,采用计算机辅助药物分子设计方法中的药效团筛选、分子对接和相互作用模式分析对传统中药数据库进行虚拟筛选。结果从含有37 170个化合物的传统中药数据库中优选出20个活性较好的化合物,通过进一步的氢键作用分析确认3个先导化合物。结论该研究为新型抗动脉粥样硬化PPARα激动剂的发现提供了新的方法和理论依据。     

细胞膜色谱法及其在中药活性成分分析中的应用(英文)

中药经过了长期的临床试验,具有可靠的治疗效果,并为新药开发提供极好的活性化合物库,已逐渐得到全球范围内的广泛关注。中药中通常含有成百上千的化学物质,但其中只有少数的化合物具有药理作用,而其余大多数成分的存在使得分析和筛选中药的活性成分非常困难。因此,探寻用于分析和筛选中药活性成分的策略是中药研究中长期关注的问题,细胞膜色谱法已成为研究中药活性成分的有效方法。本文将概述细胞膜色谱法的原理、特点、应用前景及其在中药研究中可能面临的问题,细胞膜色谱法在中药活性成分分析和筛选中的作用将日益突出。     

细胞膜色谱法及其在中药活性成分研究中的应用

细胞膜色谱法作为一种新兴的色谱技术,将药物效应成分的分离和活性筛选结合在一起,因此特别适用于中药及天然药物的物质基础研究。对细胞膜色谱技术在中药活性成分研究方面的应用做一简要综述,为该技术的进一步研究和应用提供参考。     

夏枯草中抗偏头痛组分的筛选研究

目的采用细胞膜色谱法筛选夏枯草中抗偏头痛的活性成分。方法通过大鼠纹状体组织制备得到细胞膜色谱固定相,建立离线的细胞膜色谱-高效液相色谱系统,特异性地识别夏枯草提取液中可与固定相上5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受体1D亚型(5-HT_(1D))发生作用的成分,并通过区带流出法研究药物与受体作用的平衡解离常数(KD)。结果通过紫外光谱及高效液相色谱分析,发现熊果酸是细胞膜色谱保留的主要成分,并测得熊果酸与5-HT_(1D)受体作用的KD值为(6.79±0.41)×10~(-6)mol·L~(-1)。结论经细胞膜色谱筛选发现,熊果酸是夏枯草中可与5-HT_(1D)作用的活性成分。     

普伐他汀和阿司匹林对CD40-CD40L表达及斑块稳定性的影响

目的：研究普伐他汀和阿司匹林对兔腹主动脉粥样硬化斑块CD40-CD40L表达及斑块稳定性的影响。方法：新西兰大白兔32只予高脂饲养16wk及腹主动脉球囊损伤术建立腹主动脉粥样硬化模型,分4组：P组（普伐他汀）、A组（阿司匹林）、A＋P组（联合用药）与N组（不用药）,分别予相应药物灌胃8wk。通过免疫组化检测比较各组兔腹主动脉粥样硬化斑块内CD40-CD40L表达、MMP-1、胶原及脂质含量变化,超声检测腹主动脉内膜-中膜厚度（IMT）改变,ELISA法测定血清C反应蛋白（CRP）变化,分析2药干预动脉粥样硬化斑块稳定性的机制。结果：用药各组兔腹主动脉斑块内CD40-CD40L表达较N组显著受抑,普伐他汀作用更显著（P组和A＋P组均P＜0．01）；同时各用药组MMP-1的表达、IMT增厚及CRP增高较N组均得到明显抑制（P＜0．01）,P组和A＋P组较N组斑块内脂质显著减少（P＜0．01）,胶原含量明显增加（P＜0．01）。结论：普伐他汀和阿司匹林都可抑制斑块CD40-CD40L系统的表达,促进斑块的稳定性。普伐他汀促进斑块稳定的机制可能是多方面的。     

吡格列酮对动脉粥样硬化兔CD40-CD40L系统的影响

目的通过观察吡格列酮对动脉粥样硬化（AS）兔血脂、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平及斑块/内膜面积比以及斑块部位炎症细胞CD40表达的影响,探讨吡格列酮与CD40-CD40L系统相互作用机制以及其对兔动脉粥样硬化的影响。方法雄性日本大耳白兔,随机分为4组,每组10只。A组（正常对照组）：普通颗粒饲料喂饲;B组：（高脂模型组）高脂饲料喂饲;C组（高脂模型吡格列酮低剂量组）：高脂饲料喂饲同时给予吡格列酮1mg/（kg？d）灌胃;D组（高脂模型吡格列酮高剂量组）：高脂饲料喂饲同时给予吡格列酮2mg/（kg？d）灌胃,共16周。在饲养开始前及结束后检测如下指标：①血脂;实验结束后观察：②血清hsCRP;③sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L;④斑块/内膜面积比;⑤免疫组织化学法测定斑块部位巨噬细胞、平滑肌细胞CD40的表达。结果饲养开始前B、C、D组与A组比较,血脂水平无显著性差异,16周后,B、C、D组血脂水平与A组比较均显著升高（P＜0.01）;C、D组血清hsCRP水平显著低于B组（P＜0.01）;C、D组sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平显著降低（P＜0.01）。结论吡格列酮有抑制动脉粥样硬化斑块形成和血管内皮保护功能,而这些功能可能与其阻CD40-CD40L系统有关。     

基于SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱的北豆根中潜在抗肿瘤活性组分筛选及验证

目的 从北豆根中筛选与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)作用的活性成分，为抗肿瘤药物研究提供新的先导化合物。方法 构建SNAP-tag-EGFR细胞膜色谱模型，将其与高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱构成二维联用系统，靶向筛选北豆根中EGFR的潜在抗肿瘤活性组分。用前沿分析和计算机模拟分子对接研究潜在活性组分与EGFR的相互作用。并用细胞增殖抑制实验初步验证潜在抗肿瘤活性组分的药理作用。结果 利用该二维联用系统从北豆根提取物中识别出目标组分蝙蝠葛苏林碱和蝙蝠葛碱。前沿分析测得蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱与EGFR相互作用的平衡解离常数K_D值分别为2.48×10^-6、3.57×10^-6 mol·L^-1,表明蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱与EGFR均存在一定强度的相互作用关系。分子对接实验表明蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱均可结合于EGFR的活性腔，与EGFR的氨基酸残基形成氢键。细胞增殖抑制实验结果显示，蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱在5～100μmol·L^-...     

分子生物色谱技术在中药研究中的应用进展

［摘要］分子生物色谱技术是一种以生物大分子为固定相配基的高效液相色谱（HPLC）技术,是基于分子特异性识别原理逐渐发展起来,在中药活性成分筛选、药物相互作用研究、质量控制方法等方面发挥重要作用。概述了分子生物色谱技术的基本原理及其应用于中药研究的特色。对分子生物色谱法在中药研究过程中的应用予以评价,并对其发展前景进行了展望。     

靶向CD155及其受体的药物研究进展

分化簇155（CD155）是一种单次跨膜的细胞表面蛋白,在正常组织中表达量很少或不表达,但在包括胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌的多种恶性肿瘤中高表达,使其能够成为抗肿瘤药物的理想靶点。CD155作为细胞黏附分子参与肿瘤细胞的黏附、迁移和极化,还作为免疫调节分子与T细胞或NK细胞上的包括TIGIT、DNAM-1、CD96的共刺激或共抑制受体相互作用,发挥免疫调节作用,影响免疫微环境。目前靶向CD155及其受体的药物研发火热,其高亲和力受体TITIG有多种药物进入III期临床,直接靶向CD155及其受体DNAM-1和CD96的肿瘤治疗也逐渐增加。通过对靶向CD155及其受体的药物研究进展进行综述,以期为后续的药物研发提供依据。     

CD40-CD40L系统对主动脉粥样硬化兔血浆黏附分子水平的影响

目的探讨CD40-CD40配体系统(CD40-CD40L)对不同因素致动脉粥样硬化形成的血浆黏附分子影响。方法 40只实验兔随机分为5组,每组8只。A组(正常对照组):普通颗粒饲料喂饲;B组(高脂模型组):高脂饲料喂饲;C组(高脂模型CD40阻断组):高脂饲料喂饲同时给予抗CD40配体抗体0.5ml(250μg),腹腔注射,每周两次;D组(免疫刺激组):应用肺炎衣原体感染制备动脉硬化模型;E组(免疫刺激CD40阻断组):制备模型的同时给予抗CD40配体抗体0.5ml(250μg),腹腔注射,每周两次;实验共16周。实验结束后,检查如下指标:①ELISA法检测sCD40L、sVCAM-1、sICAM-1。斑块/内膜面积比。16周末获取标本检测分析。结果 B、C、D、E组与A组比较sCD40LsVCAM-1、sICAM-1水平升高(P<0.01)。C、E组与B、D组比较sCD40L、sVCAM-1、sICAM-1水平降低(P<0.01)。结论通过高脂饮食、免疫刺激可引起实验兔sCD40L、sVCAM-1、sICAM-1水平升高,阻断CD40-CD40L,可降低实验兔sCD40L、sVCAM-1、sICAM-1水平,从而抑制炎症反应、延缓动脉粥样硬化进展。     

灯盏花、丹参液在体外对血小板活化抑制作用的研究

目的通过对灯盏花素、丹参在体外对血小板活化抑制作用观察,分析血小板相关活化指标的变化情况,为中医优选活血化瘀药物提供客观理论依据。方法用三色流式细胞术法分析灯盏花素、丹参在体外对血小板活化指标血小板膜表面纤维蛋白原受体（PAC-1）和P-选择素（CD62P）抑制的变化。结果灯盏花素、丹参对ADP活化的血小板膜表面纤维蛋白原受体（PAC-1）和血小板内P-选择素（CD62P）表达都有抑制作用,并且随着药物浓度的增加,抑制作用增强;丹参能显著抑制PAC-1和CD62P两者的表达;灯盏花素抑制PAC-1表达的作用显著,但对CD62P表达的抑制较小。结论与灯盏花素相比,丹参是一种较强的抗血小板活化药物,既可抑制PAC-1的表达而降低血小板的聚集性,又可抑制血小板的释放而降低其促凝血活性,在血栓性疾病的防治中有重要作用。     

CD40-CD40配体相互作用对培养的人单核细胞二酰基甘油-蛋白激酶C信号通路及胞内Ca^2＋的影响

目的：探讨CD40-CD40配体(CD40L)相互作用是否能激活人外周血单核细胞(PBMC)内二酰基甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)信号通路．方法：细胞内DAG含量采用放射酶标记、薄层层析和放射自显影方法检测．细胞PKC活性及胞内游离钙分别采用[γ-^32P]ATP磷酸转移法和Fluo-3荧光负载流式细胞术检测．结果：CD40L以剂量依赖方式刺激人外周血单核细胞合成DAG,并具有双时限性变化,第一峰值在20s,第二峰值在10min时出现．然后DAG水平缓慢下降,至少持续20-30min．单核细胞蛋白激酶,C总活性受CD40L刺激后明显增加,峰值在12min,持续20min以上．并且这种作用主要是胞浆PKC活性向胞膜PKC活性转位所致．CD40L,能刺激胞内游离Ca^2 出现短暂的快速升高,继之为持续阶段．移去细胞外Ca^2 ,胞内快速阶段无影响,而持续阶段明显受到抑制．抗CD40抗体能显著抑制CD40L引起的胞内DAG-PKC信号通路激活及[Ca^2 ]i的动态变化．结论：CD40-CD40L相互作用能激活人外周血单核细胞[Ca^2 ]i动态变化及二酰基甘油-蛋白激酶C信号通路．     

分子生物色谱技术中生物大分子在中药研究中的应用进展

分子生物色谱技术是基于分子特异性识别原理逐渐发展起来,具有重现性好、分析速度快、具有药理学意义等特点,适用于中药药效物质基础的筛选研究。本文综述了近10年国内外关于分子生物色谱法在药物研究中应用的文献,着重介绍了分子生物色谱技术中常用生物大分子如血浆蛋白、受体、酶等及其在中药研究中的应用,如活性成分筛选、药物相互作用研究、质量控制方法等,以期为分子生物色谱法的广泛应用提供参考。     

丹参多酚酸盐对ApoE~(-/-)小鼠主动脉壁细胞清道夫受体A和CD36 mRNA表达的影响

目的观察中药丹参多酚酸盐对ApoE基因敲除小鼠主动脉壁血管细胞清道夫受体A和CD36mRNA表达的影响,探讨丹参多酚酸盐抗动脉粥样硬化进展的作用机制。方法 30只AopE基因敲除小鼠(4周龄,雄性)随机分成4组,即模型组(腹腔注射生理盐水,7只)、丹参多酚酸盐60 mg/kg组(7只)、丹参多酚酸盐120 mg/kg组(8只)、丹参多酚酸盐240 mg/kg组(8只),正常对照组(C57BL/6J野生型小鼠)6只。高脂饮食喂养于24周末时处死各组动物,取主动脉根部连续切片,常规苏木精-伊红染色,观察血管壁形态和脂质沉积情况,采用逆转录聚合酶链式反应对主动脉血管壁细胞清道夫受体A和CD36 mRNA表达进行定性和定量分析。结果 ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化斑块内均可见明显的SR-A和CD36mRNA表达,C57BL/6J小鼠正常血管内仅见少量表达;丹参多酚酸盐(240 mg/kg组)干预后,与模型组比较,ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化斑块内CD36 mRNA表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),而SR-A mRNA的表达未见明显减少(P>0.05)。结论中药丹参多酚酸盐抗ApoE~(-/-)鼠主动脉粥样硬化可能与其下调CD36mRNA表达,减少巨噬细胞泡沫细胞的形成有关,而与SR-A无关。     

硫酸锌对高脂喂养载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉基质金属蛋白酶-9和CD40表达的影响

目的探讨硫酸锌对高脂喂养载脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠血脂和氧化低密度脂蛋白（oxLDL）水平,及主动脉中基质金属蛋白酶9（MMP-9）和细胞分化抗原40（CD40）mRNA表达的影响。方法 AopE基因敲除小鼠连续14周喂饲高脂饲料,同时分别给予小鼠浓度为2.5、25 mmol/L硫酸锌水溶液作为低剂量组和高剂量组。测定小鼠血脂和oxLDL水平,并测定主动脉中MMP-9和CD40 mRNA表达水平。结果低剂量组和高剂量组小鼠血清中甘油三酯和oxLDL水平明显低于动脉粥样硬化（AS）模型组（P〈0.01）。低剂量组和高剂量组小鼠主动脉MMP-9 mRNA和CD40 mRNA水平与AS模型组没有差异。结论补充硫酸锌降低了AS模型动物的甘油三酯和oxLDL水平,具有潜在的抗AS作用,但对主动脉MMP-9和CD40 mRNA表达无影响。     

用SMMC-7721和Hep-G2全二维细胞膜-整体柱色谱联用技术筛选中药鸦胆子的抗癌活性物质

目的筛选中药鸦胆子中的抗癌活性成分。方法同时使用全二维色谱技术和细胞膜色谱技术联用质谱技术。结果经初步分离筛选,得到了腺苷和鸦胆子苦素B两种潜在的抗癌活性成分。结论该方法对中药中活性成分的筛选,具有快速、高效和在线的特色和优点。