编码N端截短的IκBα突变体重组腺病毒的构建与鉴定

目的：通过去除N端丝氨酸32/36磷酸化位点，获得人胎盘组织IκBα突变体（IκBαM）基因，构建其复制缺陷型重组腺病毒（AdIκBαM），并进行体外表达和活性检测。方法:PCR定点克隆IκBαM基因（203-1 003 bp），亚克隆至pShuttle和pGEM-T，进行PCR、双酶切、DNA测序和同源性分析。将重组质粒pShuttle-IκBαM中含CMV启动子、IκBαM cDNA和PolyA信号的表达单元定向插入Ad5腺病毒载体，构建成重组腺病毒AdIκBαM，再经脂质体介导共转染293细胞进行包装。Western blotting检测AdIκBαM在293细胞中蛋白表达情况，电泳迁移率实验观察AdIκBαM抑制佛波酯诱导的ECV304细胞核因子κB（NF-κB）激活的作用。结果:成功克隆长801 bp的新型IκBαM基因，与GenBank中登陆的IκBα基因（接受号M69043）相应核苷酸序列一致。所制备的AdIκBαM滴度为4.0×1012 pfu/L。AdIκBαM介导IκBαM基因在293细胞中表达，并以剂量依赖性方式显著抑制佛波酯诱导的ECV304细胞NF-κB活化 。结论：AdIκBαM有效介导IκBαM基因表达并特异性抑制NF-κB活性，有望应用于哮喘的基因治疗。     

NF-κB超抑制物IκBαM重组腺病毒的构建

目的 在克隆IκBα基因并构建IκBαM的基础上，构建重组腺病毒AdIκBαM。方法 将IκBαM克隆至穿梭质粒，线性化后与骨架质粒共同转染BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，观察绿色荧光以确定转染结果，以Western blot法检测目的基因表达。结果 凝胶电泳及行酶切鉴定表明同源重组成功；一PCR产物测序证明确为lxBaM；以重组腺病毒质粒转染293细胞，见绿色荧光；感染293细胞得到大量病毒。结论 成功构建了IκBαM重组腺病毒，为进一步研究奠定了基础。     

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备

目的利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒,制备TrxA/IκBα融合蛋白,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体. 方法以重组质粒pGEM-T-IκBα为模板,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA,经相应酶切后插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达TrxA/IκBα融合蛋白.Western blot试验鉴定表达蛋白.超声波破菌后采用Ni-NTA树脂对TrxA/IκBα融合蛋白进行纯化. 结果酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了TrxA/IκBα融合蛋白,其相对分子质量(Mr)约为56×103,表达量约占细菌总蛋白的25%.Western blot试验显示TrxA/IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应.经Ni-NTA树脂纯化后,TrxA/IκBα融合蛋白的纯度可高达95%以上. 结论人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础.     

IκBαM重组腺病毒的构建

为从分子水平研究NF κB/IκBα系统复杂的生物学功能特别是在肿瘤抗凋亡机制中的作用、进而应用其进行肿瘤及其它多种疾病的基因治疗研究 ,我们在成功克隆IκBα基因基础上 ,构建了NF κB超抑制物IκBαM。在此基础上应用新型腺病毒载体构建系统AdEasysys tem构建重组腺病毒AdIκBαM。首先将目的基因IκBαM克隆至穿梭质粒Track CMV质粒 ,提取重组Track IκBαM质粒 ,行单酶切及双酶切鉴定 ,表明重组穿梭质粒Track IκBαM构建成功。以碱法提取重组穿梭质粒Track IκBαM基金项目 :国家 863计划资助项目( 2 0 0 1AA2 1712…     

共表达IκBα-IRES2-CD40L胞外区双基因的腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建含有分泌型人CD40L胞外区(shCD40L)和IκB的双基因共表达的腺病毒载体。方法:分别扩增出目的基因片段shCD40L、IκB和IRES2,将目的基因进行连接,得到IκB-IRES2和shCD40L两个基因片段,将其分别导入pGEMT-easy载体进行亚克隆扩增,测序正确后,再将连接成功地两个目的基因片段与分别与载体pshuttle-CMV连接获得穿梭质pshuttle-CMV-shCD40L和pshuttle-cmv-IκB-IRES2,将穿梭质粒在DH5α感受态细胞中扩增。再与AdEasy-1-BJ5183菌同源重组,得到含有两个目的基因的腺病毒骨架,脂质体法转染293细胞,包装成具有感染能力的共表达IκB-IRES2-shCD40L腺病毒颗粒。PCR法对腺病毒的上清液中的表达差异进行鉴定,检测病毒滴度,并用其感染细胞PK15和293细胞以检验其安全性。结果:所构建的IκB-IRES2-shCD40L基因的重组腺病毒,经酶切和PCR鉴定正确,原代腺病毒的滴度达到6.561×1012pfu/L,PCR法从提取的病毒上清液中分别扩增出了是shCD40L(600bp)和IKBa(700bp)的特异性片段,感染了腺病毒后的PK15细胞形态未见明显异常,但293细胞出现了明显的气球样变。结论:成功构建了共表达IκBα-IRES2-shCD40L双基因的腺病毒载体。     

去甲斑蝥素增强Bel7402中IκBα表达和抑制细胞增殖的研究

目的　从核转录因子 NF- κB和其抑制分子 IκBα的相互作用揭示去甲斑蝥素的抗肿瘤作用机理 ,为其进一步开发利用提供理论依据。　方法　选用人肝癌细胞株 (Bel740 2 ) ,常规培养 ,分为细胞对照组及去甲斑蝥素不同浓度组 ,进行细胞生长曲线测定、细胞集落形成实验及 MTT实验 ;同时对细胞进行 Giem sa染色、免疫细胞化学染色 (一抗分别为 anti- p6 5、anti- IκBα)。Western blot检测 IκBα的表达。　结果　生长曲线测定 ,细胞集落形成实验及 MTT实验结果表明 ,去甲斑蝥素对人肝癌细胞株的生长有明显的抑制作用 ;免疫细胞化学及 Western blot结果显示 :去甲斑蝥素可增强细胞内 IκBα的表达 ,并抑制 NF- κB的表达与活性。　结论　去甲斑蝥素有良好的抗肿瘤效应 ,其作用机理可能与其能增强核转录因子 NF- κB的抑制分子 IκBα的表达有关。     

重组腺病毒ΔN IκBα的构建及其对A549细胞中NF-κB活性的抑制

目的: 探讨ΔN IκBα基因对NF-κB活性的调节作用.方法: 构建去除Ser32和Ser36磷酸化位点的IκBα重组腺病毒Ad-ΔN IκBα.A549细胞分为3组: 即LPS组、 Ad-LacZ+LPS组和Ad-ΔN IκBα+LPS组.LPS组单纯用内毒素(LPS)激活NF-κB; Ad-LacZ+LPS 组及Ad-ΔN IκBα+LPS 组在用LPS前2 d, 分别感染Ad-LacZ和Ad-ΔN IκBα.用Western blot、电泳迁移率变动分析(EMSA)和ELISA法分别检测LPS刺激后5 h, 细胞总蛋白中NF-κB的活性和培养上清中TNF-α及IL-6的含量.结果: Ad-ΔN IκBα+LPS组NF-κB的活性, TNF-α和IL-6的含量, 均显著低于LPS组及Ad-LacZ+LPS组.结论: 突变后的IκBα可明显抑制NF-κB活化, 减少TNF-α和IL-6的释放, 有望成为一种强有力的抗炎治疗制剂.     

羟基喜树碱通过激活NF-κB诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡

 目的: 探讨NF-κB信号转导途径在羟基喜树碱诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡中所起的作用。方法: 突变IκB-α-pcDNA3.1(-)质粒转染Bcap-37细胞，并用G418进行阳性克隆选择；采用MTT法测定细胞的增殖活力，琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡，流式细胞仪进行细胞周期分析，Western blotting法和DIG-EMSA研究细胞凋亡途径。结果: 羟基喜树碱对Bcap-37有明显的生长抑制作用，琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯状条带；羟基喜树碱可通过降解IκBα 蛋白进而激活NF-κB，并使NF-κB发生核移位；羟基喜树碱没有激活突变IκB-α-pcDNA3.1(-)质粒转染细胞的NF-κB，并且转染细胞凋亡受到抑制。结论: 羟基喜树碱对Bcap-37有明显的生长抑制和诱导凋亡作用；NF-κB 信号转导途径在羟基喜树碱诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡中起着促进凋亡的作用。     

rhGH对Jurkat细胞中NF-κB活性的影响

目的:探讨重组人生长激素(rhGH)对Jurkat细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路活化的影响.方法:(1)将含荧光素酶报告基因的质粒pNF-κB-luc转染入T淋巴细胞系-Jurkat E6-1细胞中,在培养液中加入梯度浓度rhGH.(2)用梯度浓度rhGH直接刺激Jurkat细胞,然后用RT-PCR方法检测IκBα、IKK1 mRNA表达情况.结果:各浓度rhGH对转染pNF-κB-luc的Jurkat细胞中荧光素酶表达有促进作用,而对IκBα、IKK1 mRNA表达无显著影响.结论:rhGH对PHA活化的T细胞NF-κB的活化有促进作用,而对与NF-κB活化相关的IκBα和IKK1的mRNA表达无显著影响.     

霍奇金淋巴瘤中ΙκΒα基因突变的研究

目的分析霍奇金淋巴瘤细胞中IκBα基因突变的特点、可能造成的蛋白结构异常,并探讨其分子病理学意义。方法应用激光显微切割技术分离16例霍奇金淋巴瘤切片中的HRS细胞,并对IκBα基因进行半巢式PCR扩增及DNA直接测序,检测HRS细胞IκBα基因6个外显子突变。结果16例标本中6例发现IκBα基因突变,突变率为37.5%,突变分别位于1、4、5和6外显子上。其中2例第五外显子出现点突变,形成TGA终止密码子;1例出现第四外显子单碱基缺失突变,形成框移,可造成IκBα蛋白羧基端缺失。霍奇金淋巴瘤背景中反应性淋巴细胞没有发现IκBα突变。结论霍奇金淋巴瘤IκBα基因突变率为37.5%,高于文献报道(10%～25%)。突变可能造成IκBα蛋白的结构异常,通常造成羧基端截短改变。背景中反应性增生的淋巴细胞未发现IκBα基因突变,表明IκBα的基因突变是HRS细胞的特征,并可能在霍奇金淋巴瘤发病机制中起重要作用。     

SUMO化修饰对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞IκB/NF-κB信号的影响

目的 探讨小泛素相关修饰物(SUMO)修饰对高糖诱导的肾系膜细胞IκB/NF-κB信号的影响.方法 体外培养正常大鼠肾小球系膜细胞,设对照组、不同浓度高糖干预组和渗透压对照组,用免疫共沉淀检测SUMO1,SUM02/3蛋白与IκBα蛋白的相互作用;免疫印迹检测IκBα、NF-κB P65蛋白表达.结果 高糖特异性地减弱肾系膜细胞SUMO2/3与IκBα蛋白间的相互作用(P＜0.05);高糖呈浓度-时间依赖性促进IκBα泛素化降解(P＜0.05),同时上调NF-κB P65表达(P＜0.05).结论 高糖特异性减弱IκBα的SUMO化修饰,可能介导了肾系膜细胞、NF-κB信号的激活,参与了糖尿病肾病的发病.     

内毒素、地塞米松对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞中NF-κB活化的影响

目的 探讨内毒素（LPS）和地塞米松（Dex)对体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞（AM）中NF－κB活化的影响，以及AM中NF－κB活化在急性肺损伤中的可能作用。方法 通过建立大鼠AM体外培养技术，应用免疫组化染色法，观察LPS和Dex对AM中NF－κBP^65,IκB-α，TNF-α和ICAM－1蛋白表达的动态变化。结果 LPS能使培养的AM中NF－κBP^65,TNF-α和ICAM－1的表达增加，IκB－α的表达降低；Dex的作用与LPS恰相反。结论 LPS促进AM中的NF－κB活化，可能是急性肺损伤肺内炎症损害发生的启动及促进因素，Dex抑制NF－κB的活化，可能是其抗炎作用的重要机制之一。     

NF-κB在人肝细胞肝癌中的表达及与HBV X蛋白的关系

目的：研究核转录因子NF－-κB在人肝细胞肝癌组织中的表达及其与乙型肝炎病毒（HBV ）X蛋白的关系。方法；用免疫组织化学S－P法，检测52例人肝细胞肝癌组织中核转录因子NF－-κB及HBV X蛋白的表达；用脂质体介导的基因转染法将HBV x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX转染入人肝癌细胞系HCC－9204，检测肝癌细胞内核转录因子NF－-κB的表达。结果：52例人肝细胞肝癌组织均有核转录因子NF－-κB的广泛表达，并且在11例HBV X蛋白阳性的肝癌组织，核转录因子NF－-κB位于细胞胞质和胞核，而在41例HBV X蛋白阴性的肝癌组织，核转录因子NF－-κB位于肝癌细胞的胞质。将HBV x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX转染 入人肝癌细胞系HCC－9204，并在稳定表达X蛋白 的肝癌细胞，核转录因子NF－-κB定位于其胞质和胞核，而未进行基因转染的亲体细胞，核转录因子NF－-κB仅定位于细胞质，细胞核无核转录因子NF－-κB的表达。结论：核转录因子NF－-κB在人肝细胞肝癌组织中广泛表达，人肝细胞肝癌中存在着核转录因子NF－-κB的异常激活，并且核转录因子NF－-κB的异常激活与HBV X蛋白有关，X蛋白激活核转录因子NF－-κB， 使其从细胞转位于细胞核，这可能在HBV相关的人原发性肝癌肝癌的发生中起一定作用。     

妊娠滋养细胞疾病中NF-κBp65和IκBα的表达及临床意义

目的:分析核转录因子κB p65(NF-κBp65)和核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)在正常早孕绒毛及妊娠滋养细胞疾病中表达的差异性,以及与妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)(包括侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌)患者年龄及临床分期的关系。并探讨两者在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的相关性。方法:采用免疫组化方法(SP法)检测20例正常早孕绒毛组织、30例葡萄胎组织、13例侵蚀性葡萄胎和15例绒毛膜癌中NF-κBp65和IκBα的表达情况。结果:NF-κBp65在正常早孕绒毛组与侵蚀性葡萄胎组、正常早孕绒毛组与绒毛膜癌组、葡萄胎组与侵蚀性葡萄胎组、葡萄胎组与绒毛膜癌组之间阳性表达率比较差异均具有统计学意义(P=0.013,0.018,P=0.026,0.035,P<0.05);IκBα在正常早孕绒毛组与侵蚀性葡萄胎组、正常早孕绒毛组与绒毛膜癌组、葡萄胎组与侵蚀性葡萄胎组、葡萄胎组与绒毛膜癌组之间阳性表达率比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。NF-κBp65和IκBα在GTN中的表达与临床分期有关(P=0.043,0.042,P<0.05),与患者年龄无关。NF-κBp65与IκBα在GTN中呈负相关(r=-0.403,P=0.034,P<0.05)。结论:NF-κBp65上调、IκBα的下降或缺失可能与滋养细胞肿瘤的发生发展以及侵袭、转移有关,NF-κBp65、IκBα两者在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的表达呈负相关。     

CD154(CD40L)诱导人Ramos B淋巴细胞株中转录因子NF-κB活化研究

目的 对CD40配体CD154(CD40L)在人B淋巴细胞中刺激转录因子NF-κB活化进行研究。方法应用重组CD154刺激EBV／LMP1阴性人Ramos B细胞，观察对NF-κB luciferase(萤光素酶)活化的作用，判断CD154刺激对NF-κB抑制蛋白IκB-α、-β及-ε磷酸化和降解的影响，并对CD154刺激诱导进入细胞核NF-κB亚单位进行分析。结果 CD154刺激：(1)导致NF-κB lucfferase活性升高，且与CD154剂量正相关；(2)引起细胞内IκB-α、-β及-ε蛋白总量减少，IκB-α、-β及-ε阳性细胞也明显减少；(3)主要诱导p50、p65及c-Rel亚单位从细胞浆进入细胞核；(4)诱导p65磷酸化。结论 在人Ramos B细胞中，CD154通过诱导IκB-α、-β及-ε降解释放p50、p65及c-Rel进入细胞核及p65磷酸化激活NF-κB。     

SC58125 通过抑制IκBα的降解调节TNF-α 诱导的人结肠癌HT29细胞的凋亡

目的： 了解SC58125与TNF-α是否具有协同诱导HT29细胞凋亡的作用，同时探讨其可能的分子机制。方法： 用MTT、Hoechst 33342染色及琼脂糖凝胶电泳，观察SC58125/TNF-α对HT29结肠癌细胞增殖与凋亡的作用；用EMSA及Western blotting检测转录因子NF-κB的结合活性、IκBα以及磷酸化IκBα的表达。结果： SC58125与TNF-α在抑制HT29细胞增殖及诱导其凋亡方面具有明显的协同作用；表现为细胞核浓缩、核碎裂及“DNA梯带”形成；凋亡过程中伴随caspase活性的激活。经TNF-α刺激后的HT29细胞，IκBα，磷酸化IκBα迅速降解，NF-κB的结合活性大大提高，而加入SC58125后，IκBα降解及NF-κB的结合活性明显受抑制。结论： SC58125与TNF-α在诱导HT29细胞凋亡方面具有明显的协同作用，这可能与激活caspase-3 及抑制IκBα降解有关。     

霍奇金淋巴瘤IκBα基因第5外显子突变初步分析

目的分析单个霍奇金淋巴瘤细胞IκBα基因第5外显子的碱基序列,探讨IκBα基因突变与霍奇金淋巴瘤的关系。方法用免疫组织化学EnVision法检测7例霍奇金淋巴瘤CD30抗原,采用激光显微切割技术捕获CD30阳性表达的单个霍奇金淋巴瘤细胞和其周围反应性增生的淋巴细胞,以这些标本的基因组DNA为模板,用半巢式聚合酶链反应(PCR)方法扩增IκBα基因的第5外显子,PCR产物经纯化后直接测序。结果分析测序图发现3例霍奇金淋巴瘤细胞IκBα第5外显子出现点突变,均形成TGA终止密码子。结论霍奇金淋巴瘤中IκBα基因第5外显子出现点突变,可能是霍奇金淋巴瘤恶性转化过程中除EB病毒感染外另一重要分子机制。     

核转录因子NF—κB——肿瘤基因治疗的新焦点

NF－κB是一种重要的核转录因子，由一个复杂的体系组成，它存在于多种细胞，参与多种生理、病理过程的基因调控，并在细胞的抗凋亡过程中起着至关重要的作用，NF－κB系统由NF－κB家族及其抑制物IκB家族共同组成。NF－κB的激活是肿瘤细胞抵抗 TNF等抗肿瘤药物作用的重要机制。通过抑制IκB的降解来抑制NF－κB的激活可以导致肿瘤细胞的大量凋亡。因此，通过基因治疗来抑制NF－κB的活性，再辅以常规的3化疗将有望成为一个有效的肿瘤治疗方法。     

miR-122低表达对糖尿病肾病足细胞损伤和IKK/NF-κB信号通路的抑制作用研究

目的:探究微小RNA-122(miR-122)低表达对糖尿病肾病(DN)足细胞炎性因子水平、增殖、凋亡、迁移和IκB激酶(IKK)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:体外培养人肾小球足细胞HGPC,取对数生长期细胞，分为正常糖组(5mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(30mmol/L D-葡萄糖)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC片段至细胞，后加入30mmol/L D-葡萄糖)、miR-122 inhibitor组(转染miR-122 inhibitor片段至细胞，后加入30mmol/L D-葡萄糖),每组设置3个重复。24h后，实时荧光定量PCR(qPCR)测定各组细胞中miR-122表达水平，酶联免疫法(ELISA)测定细胞上清液中白介素(IL)-6、IL-1β及IL-10水平，细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法、Hoechst 33258染色法及划痕法分别测定细胞活力、增殖率、凋亡率及迁移率，蛋白免疫印迹法(WB)测定细胞中IKKα、IκBα、磷酸化(p-)IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB ...     

环氧化酶-2特异抑制剂SC236对NF-κB活性的阻断作用

目的 探讨环氧化酶-2抑制剂的抗炎和抗肿瘤作用机理。方法 利用NF-κB报告基因暂时转染人胃上皮细胞，使用环氧化酶-2特异抑制剂SC236和PMA共同处理转染的细胞后，双重虫荧光素酶系统鉴定基因的活性。用免疫蛋白印迹法检测NF-κB亚单位IκB-α和p65的含量。结果 在人胃上皮细胞AGS和MKN28细胞内，SC236有效地抑制NF-κB介导的基因转录。SC236的作用比非特异性环氧化酶抑制剂阿斯匹林更强大。SC236与阿斯匹林的作用点不同，SC236对PMA引起的IκB-α的磷酸化或降解没有作用，SC236的作用点在于抑制065亚单位的核易位。结论 环氧化酶-2特异抑制剂的抗炎和抗肿瘤作用可能部分地通过抑制NF-κB发挥作用。特异的COX-2抑制剂抑制NF-κB活性的作用点不同于非特异的环氧化酶抑制剂。