抗人TNF-α单链抗体rScFvH22原核表达及纯化

目的：应用PET32-c原核表达载体快速、高效地表达及纯化单链抗体。方法：将单链抗体H22基因克隆到PET32-c原核表达载体中，通过酶切及测序鉴定正确后，进行原核诱导表达和纯化。并检测纯化后单链抗体的功能。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳表明，单链抗体基因克隆成功；SDS-PAGE结果表明，单链抗体得到成功表达和纯化；ELISA和Western印迹结果表明，单链抗体H22能够特异性结合人TNF-α。结论：成功地表达及纯化抗人TNF-α单链抗体rSeFvH22。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

新型重组人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体的制备及活性分析

目的：利用大肠杆菌表达新型人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体ScFv,并验证其活性。方法：采用基因融合获得ScFv基因,构建重组表达质粒pET-22b（＋）-ScFv,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达。结果：Western印迹显示目的蛋白表达正确,表达产物以包涵体形式存在,经Ni-NTA柱纯化和体外复性,获得纯度达90%的ScFv蛋白。ELISA结果显示在PBS及人血清中ScFv的结合稳定性有所提高,流式细胞术证明目的蛋白能靶向结合狂犬病毒,通过中和效价测定实验测得ScFv的中和效价为40 U/mg。结论：成功利用原核表达系统实现了对人源抗GPRV ScFv的表达,并且具有一定的中和活性。     

小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化

目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体,并初步分析比较两者的体外生物活性。方法;经ＤＮＡ重组的构建重组表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中高表达两种单链抗体,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物,并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６,纯化的表达产物经复性后ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上,经变性,纯化后纯度可达９７％     

大肠杆菌错配识别蛋白MutS的表达与活性鉴定

目的构建表达错配识别蛋白MutS,并进行错配识别活性鉴定。方法在大肠杆菌中表达MutS蛋白,并纯化获得目的蛋白;利用凝胶滞缓实验对错配识别活性进行验证,并计算MutS蛋白降低的错配率。结果纯化的MutS蛋白具有错配识别活性,并能降低DNA双链的错配率。结论表达纯化的MutS蛋白在体外具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性,从而有助于合成生物学的发展。     

抗Sclerostin单链抗体基因的构建、表达及活性分析

目的 构建抗Sclerostin（SOST）单链抗体原核表达载体并对表达蛋白进行活性分析.方法 提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体轻链可变区基因（VL）和重链可变区基因（VH）并通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法,在VL和VH基因之间引入Linker（Gly4Ser）3,连接成单链抗体SOST-scFv（VL-Linker VH）.将scFv基因克隆至表达载体PET-22b（＋）后转入HEK293细胞进行分泌表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA和West-blot检测表达蛋白的反应活性,茜素红结节染色法评估单链抗体对体外培养骨髓间充质干细胞成骨矿化的影响.结果 VL基因序列全长为339个碱基对,VH基因序列全长330个碱基对,均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,而SOST-scFv基因全长包括4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）以及具有抗体特征性的2个半胱氨酸残基;本研究构建的scFv全长687个碱基对,VL-Linker-VH为连接结构,SDS-PAGE分析表明大肠杆菌表达的scFv为可溶性蛋白,ELISA和West-blot检测证实表达scFv具有与SOST特异性结合的活性,细胞实验结果证实scFv能够促进骨髓间充质细胞成骨分化及矿化结节的形成.结论 成功构建抗SOST单链抗体表达载体,而且表达的scFv产物具有确切的免疫结合活性以及体外诱导成骨分化、矿化作用,为该抗体应用于骨质疏松疾病治疗奠定了实验基础.     

重组人抗-HBs单链抗体与白细胞介素2融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

目的 探讨抗-HBs单链抗体与白细胞介素2融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定方法。方法 将构建的目的蛋白表达工程菌M15[pQE-ScFv-IL-2]经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物;再通过Ni^2 离子金属螯合亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;采用逐步透析法对纯化后的目的蛋白进行复性后,用间接ELISA实验和CTL-2细胞增殖反应实验对其进行活性鉴定。结果 SDS-PAGE及Western blot分析结果显示有分子量约为43kD的重组蛋白表达,表达量可达18％;两步纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％;复性后纯化产物的活性鉴定结果表明,重组抗体融合蛋白既能与HBsAg特异性结合,也能刺激CTLL-2细胞增殖。结论 获得的抗体融合蛋白兼具亲本分子的双特异性,为慢性乙型肝炎及相关疾病的导向治疗研究打下了良好基础。     

人细胞外基质磷酸糖蛋白MEPE的表达纯化及抗体制备

目的 原核表达、纯化人细胞外基质磷酸糖蛋白(Mepe)基因,并制备多克隆抗体.方法 设计出扩增人Mepe全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性.结果 原核表达了人Mepe全长基因,纯化了MEPE蛋白,并获得了抗MEPE的多克隆抗体,抗体效价达到1∶25 600,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的MEPE蛋白.结论 MEPE蛋白能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗－HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选60个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV核心蛋白特异性抗－Id scFv的编码序列进行测定分析。结果经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，在随机挑选的60个克隆中，有20株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应后，确定了其中有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆，提取质粒，进行DNA序列测定，DNA大小为768bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗－HCV核心蛋白的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治慢性丙型肝炎的研究创造了条件。     

重组人瘦素融合蛋白在大肠杆菌中的低温自诱导表达、纯化和活性鉴定

目的:建立低温自诱导表达重组人瘦素(leptin)融合蛋白的系统方法,经体外纯化获得大量具有生物活性的瘦素蛋白.方法:从cDNA文库中扩增瘦素编码区,克隆到pGEM-T easy载体,测序正确后亚克隆到A1.3表达载体,转入BL21(DE3),低温自诱导表达.用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定表达产物.对低温自诱导表达产物rMBP-10His-Leptin进行纯化和酶切,获得可与瘦素单抗发生特异性反应的瘦素蛋白.用Km小鼠减肥实验检验其生物学活性.结果:在22×103处有明显的新增蛋白带,含量超过总蛋白的40%,Western印迹证实为瘦素蛋白.Km小鼠减肥实验证实其具有生物学活性.结论:成功建立了低温诱导表达rMBP-10His-Leptin的系统方法,获得大量瘦素蛋白,经验证表达产物具有免疫活性和生物学活性,可供进一步基础及临床研究应用.     

肿瘤转移关键酶:人乙酰肝素酶氨基端亚基的表达纯化及鉴定

目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移的过程中起重要作用,其氨基端小亚基蛋白(Mr为8×103)对其功能活性是不可缺少的。得到此蛋白将有助于深入研究乙酰肝素酶的功能活性。方法:我们从人胎盘cDNA文库中分离乙酰肝素酶蛋白全长编码基因,将乙酰肝素酶氨基端小亚基的基因克隆入pGE-X2TK,转化大肠杆菌进行融合表达。经发酵,纯化,复性得到乙酰肝素酶的氨基端亚基蛋白。结果:得到6.9g纯度>90%的氨基端小亚基融合蛋白。GSTpull-down实验表明,此融合蛋白可与乙酰肝素酶羧基端大亚基蛋白结合。复性后的融合蛋白可被激酶切割为GST蛋白和乙酰肝素酶氨基端亚基蛋白。结论:所得的乙酰肝素酶的氨基端小亚基蛋白为进一步研究该亚基蛋白在细胞内的免疫亚定位及功能奠定了基础。     

重组人乙酰肝素酶在大肠杆菌中的表达、纯化

目的：表达纯化重组的人乙酰肝素酶（heparanase,HPA）。方法：以表达乙酰肝素酶全长质粒pcDNA3.1-HPA为模板,扩增不包括信号肽的乙酰肝素酶片段,将其插入pET-28a（＋）载体,转化到大肠杆菌BL21（plysS,DE3）中,在起始诱导菌密度、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度4个方面对诱导条件进行了优化,实现了重组人乙酰肝素酶的可溶性表达。采用HisTrapTMcrude亲和层析对目的蛋白进行了初步纯化。结果：得到了初步纯化的HPA蛋白,Western印迹证实表达产物可被乙酰肝素酶抗体和His标签抗体识别,证明表达产物具有乙酰肝素酶的免疫学特性。结论：表达纯化的人HPA蛋白为特异性单抗的制备和鉴定提供了实验材料。     

重组肉毒毒素B重链结合区片段的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素B重链结合区C端（BoNT/B Hc）保护性抗原片段.方法：采用PCR扩增BoNT/B Hc基因,插入表达载体pET-His,转化E.coli BL21（pLys）细胞获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化.利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT/B Hc的抗原性.结果：表达工程菌BL21/pETHis-BHc于37℃经0.2 mmol/L IPTG诱导6 h后,目的蛋白获得高表达,约占菌体总蛋白的24%.经过Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,rBoNT/B Hc的纯度可达96%以上.Western印迹和间接ELISA均显示其具有良好的抗原性.结论：成功克隆、表达并纯化了BoNT/B Hc片段,并可被抗天然BoNT/B马血清所识别,为建立快速检测方法和制备相应的抗体及亚单位疫苗奠定了基础.     

半乳糖凝集素-1的表达纯化与生物活性分析

目的：获得重组人半乳糖凝集素-1（galectin-1）蛋白,并分析其生物学活性。方法：PCR方法扩增目的基因,将其克隆到原核表达载体pET21a（＋）,获得重组质粒pET-galectin;将其转化至表达宿主菌BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导,获得目的蛋白的表达;采用Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,用红细胞凝集试验分析其生物学活性。结果与结论：成功构建重组原核表达质粒pET-galectin,目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化后,得到的蛋白纯度可达80%以上。红细胞凝集试验结果表明获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,可进一步用于半乳糖凝集素-1功能研究。     

血管生成素基因在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

目的：利用原核表达系统获得重组血管生成素(Ang)并研究其生物学活性。方法：构建高效融合表达载体pGEx4T—Ang，诱导表达后利用亲和层析的方法纯化目的蛋白，经切割后获得非融合的重组人Ang，利用Westem印迹检测表达产物的特异性，通过鸡胚尿囊膜血管增生实验检测重组蛋白的生物学功能。结果：表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20％，亲和层析纯化蛋白的纯度在90％，能够与Ang抗体产生特异性反应，并具有明显的促进血管新生的活性。结论：原核表达的重组Ang具有良好的生物学活性。     

人睫状神经营养因子的原核表达及其初步纯化

目的：优化条件实现人睫状神经营养因子（ｈｕｍａｎｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ｈＣＮＴＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的高效表达。方法：ＣＮＴＦ克隆进ｐＢＶ２２０后,表达,凝胶过滤纯化,１０日龄鸡背根神经节（Ｅ１０ＤＲＧｓ）测定其生物活性。结果：ＣＮＴＦ在ＨＢ１０１中高效表达,并具有生物活性。结论：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ观察到相对分子质量约为２４×１０３的预期表达产物,优化表达条件后发现其在ＨＢ１０１中的表达状况最好,用凝胶过滤纯化的重组蛋白能促进Ｅ１０ＤＲＧｓ的生长     

乙型肝炎病毒多表位嵌合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的：构建含乙肝病毒表达抗原前S1，S2（HBV preS1,preS2)优势B细胞表位与乙肝病毒核心抗原（HBcAg)的嵌合蛋白，探索其作为兼具预防和治疗HBV感染作用的新型疫苗的可能性。方法：利用分子克隆技术先后将HBV preS1(21-47AA.),preS2(133-145AA.)表位基因插入HBcAg基因中，得到HBV C144，CS1，CS1S2融合基因，分别克隆到原核表达载体pQE-30中，大肠杆菌（E.coli)M15中进行表达，用Ni^2 固相化的螯合Sepharose Fast Flow亲和层析纯化重组蛋白，最后进行抗原性的鉴定。结果：构建了HBV嵌合型颗粒蛋白表达载体，并在E.coli中高效表达出可溶性病毒样颗粒蛋白C144,CS1,CS1S2，经Ni-NTA亲和层析 化后，蛋白纯度达80％,Western印迹及ELISA证明蛋白各表位都具有抗原性。结论：本研究为进一步深入研究新型HBV治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础。     

人斯钙素1在大肠杆菌中的重组表达与活性鉴定

目的：通过原核表达的方法得到有活性的斯钙素1（ STC1）重组蛋白。方法将优化合成的STC1 DNA片段克隆到表达载体pET-32 b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌诱导表达,在变性条件下纯化包涵体,经透析复性得到可溶的斯钙素1融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。 Western印迹分析验证目的蛋白免疫活性。动物实验检测目的蛋白的生物学活性。结果构建了pET-32b（＋）-STC1表达载体,表达并纯化了STC1融合蛋白包涵体,经复性、凝血酶切和纯化后获得可溶的目的蛋白。 Western印迹分析验证正确。生物学活性检测表明重组STC1能增加大鼠排泄系统对磷酸盐的重吸收。结论获得了具有生物学活性的斯钙素1重组蛋白,为制备STC1单克隆抗体和进一步研究STC1与肿瘤治疗的关系奠定了基础。