强力霉素人工抗原的制备及鼠源多抗的ELISA鉴定

为制备强力霉素（Doxycycline,DC）人工抗原并获得免疫学特性良好的DC鼠源多抗血清。本试验采用琥珀酸酣法在DC分子上引入羧基基团,然后采用改进碳二亚胺法（EDC）将其与载体蛋白偶联制备人工抗原,经紫外扫描（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定其偶联效果,以30 μg/只的剂量（人工抗原）免疫4只BALB/c小鼠,并对所获鼠源多抗血清采用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定其免疫学特性。结果表明,人工抗原偶联效果良好,免疫的4只小鼠多抗血清效价均达到1:12800,且均有抑制效果,其中4号小鼠产生的多抗血清效果最佳,半数抑制浓度（IC50）为24.75 ng/mL,与土霉素、金霉素、四环素的交叉反应率分别为3.4%、3.8%、3.0%,与其他兽药及载体蛋白的交叉反应率均小于0.3%,特异性良好。本试验成功合成DC人工抗原并获得免疫学特性良好的DC鼠源多抗血清,为后期单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立奠定良好基础。     

伏马菌素B2人工抗原的制备研究

为制备伏马菌素B2人工抗原,通过戊二醛法和碳二亚胺法将伏马菌素B2偶联到栽体蛋白上,人工抗原免疫BALB/c小鼠后,酶联免疫吸附法测定抗血清的效价,竞争酶联免疫吸附法测定人工抗原的免疫原性.通过氨基化和羧基化的苏丹红作为内参,紫外可见光谱扫描图谱鉴定伏马菌素B2成功偶联到载体蛋白上,免疫原性鉴定证明,碳二亚胺法制备的人工抗原可刺激BALB/c小鼠产生抗伏马菌素B2的抗体.     

伏马菌素B_1兔源多克隆抗血清的制备与鉴定

目的:合成伏马菌素B1(FB1)人工抗原,制备敏感性高、特异性强的FB1兔源多克隆抗血清。方法:采用EDC法制备人工抗原,将FB1分别偶联于载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上。通过免疫新西兰兔制备多抗血清,间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA鉴定敏感性和特异性。结果:2只新西兰兔生产的多抗血清效价在1∶1.28×105以上,其中,2号多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为17 ng/mL,且具有良好的特异性。结论:成功制备了敏感性高、特异性强的FB1兔源多克隆抗体血清,为建立FB1免疫学快速检测方法提供了理论基础。     

杂环胺人工抗原的合成以及多克隆抗体的制备

为建立适用于一类杂环胺的酶联免疫吸附检测方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),利用改良的碳化二亚胺法将在2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉(2-amino-3,4,8-trimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoxaline,4,8-DiMeIQx)的2-氨基处连接丁二酸单甲酯酰氯制备的半抗原偶联蛋白获得人工抗原。该方法利用适当pH值的缓冲体系,将酯的水解和蛋白偶合一步完成,与传统方法相比,有效地节省了反应时间和成本,且对人工抗原的紫外扫描验证和多克隆抗体效价检测结果都直接和间接地表明偶合是成功的。最终免疫获得4,8-DiMeIQx结构类似物的多克隆抗体,该抗体的最高效价为1∶450 000,且经直接竞争ELISA检测,该抗体对目标物4,8-DiMeIQx的灵敏度(IC50)为24.0μg/L,最低检测限(IC15)为1.8μg/L,对其结构类似物7,8-DiMeIQx、8-Me IQx、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉(IQx)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉(Tri Me IQx)的灵敏度分别为35.0、30.0、28.0、40.0μg/L,而其他与目标物结构相差较大的杂环胺,像2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(Ph IP)、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹啉(IQ)和2-氨基-3,4-二氨基咪唑[4,5-f]喹啉(2-amino-3,4-dimethyl-imidazo[4,5-f]quinoline,Me IQ),它们几乎不与抗体结合(CR0.01%)。由此可见,可以利用该抗体建立高效快速的杂环胺ELISA检测方法用以定量或定性检测肉类加工食品中的一类杂环胺。     

甲硝唑人工抗原的合成及鼠源多抗的制备

为了获得效价高、特异性好的甲硝唑（metronidazole,MNZ）的小鼠多抗血清,采用琥珀酸酐法将甲硝唑上的羟基改造成羧基,然后通过碳二亚胺法把改造后的甲硝唑分别与牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,制备免疫原MNZ-BSA和包被原MNZ-OVA。经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步鉴定偶联成功。将免疫原MNZ-BSA分成20 μg/只和50 μg /只2 个剂量分别免疫8 周龄的BALB/c小鼠。获得了效价高、特异性好的小鼠多抗血清,效价均达到1∶104以上,IC50值为61.39 ng/mL。     

呋喃唑酮人工抗原的制备与鉴定

为了制备3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的完全抗原,作者以乙醇肼和碳酸二甲酯为原料,首先合成了3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ),然后通过对醛基苯甲酸对AOZ进行衍生制得3-(4-羧基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(CPAOZ),以CPAOZ作为半抗原,经水溶性碳化二亚胺法(EDC),缩合酯化法(DCC)和混合酸酐法(MA)法3种方法分别与载体蛋白偶联,合成人工抗原。对于制备产物通过紫外光谱扫描分析进行了鉴定,3种抗原的偶联比率分别为8、12、17。采用3种抗原做为包被原,建立了酶联免疫(ELISA)抑制曲线。结果表明,对AOZ的半数抑制率(IC50)分别为12.9、7.6、1.1 ng/mL。采用混合酸酐法(MA法)制备的包被抗原与抗体具有较好的匹配性。3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ),是硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮在动物体内的稳定代谢物,采用本试验制备的抗原,有望获得特异性更好的抗体。     

胭脂红酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备

为了快速高效检测食品中胭脂红酸含量,本研究通过羟基二咪唑法制备了胭脂红酸人工抗原;通过免疫新西兰大耳白兔获得了胭脂红酸抗血清,经硫酸铵沉淀法分离纯化获得抗胭脂红酸多克隆抗体;利用棋盘滴定法检测了抗体效价,并探究了溶液pH值、离子强度和有机溶剂对ELISA反应的影响,优化出最佳ELISA反应条件;在最佳反应条件下,建立了胭脂红酸的间接竞争ELISA抑制曲线。紫外光谱扫描结果显示,免疫抗原(CA-BSA)和检测抗原(CA-OVA)均与载体蛋白成功偶联;经分离纯化获得的胭脂红酸多克隆抗体效价为1:16000;检测抗原最佳浓度为1μg/m L、ELISA反应最适缓冲液为pH7.4、含50mmol/L Na~+且无甲醇的磷酸盐缓冲液;间接竞争ELISA标准曲线的线性范围为7.8～1150ng/mL,检测限为1ng/mL,灵敏度IC_(50)值为95.2ng/mL。本研究为开发CA快速检测试剂盒对食品中胭脂红酸含量的大量快速测定奠定了基础。     

盐酸可乐定人工抗原的合成及鼠源多抗血清ELISA鉴定

目的：获得敏感性高,特异性强的新型瘦肉精盐酸可乐定（Clonidine hydrochloride,CLO）鼠源多抗血清。方法：以CLO的衍生物盐酸阿可乐定（Apraclonidine hydrochloride,ACLO）为半抗原,采用戊二醛法将ACLO分别与牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）和鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）偶联,合成免疫抗原CLO-BSA和包被抗原CLO-OVA。采用紫外扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其偶联效果后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清。利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定其免疫学特性。结果：合成的人工抗原免疫效果较好,所获小鼠多抗血清效价均达到1∶12 800以上,其中3号小鼠敏感性最好,半数抑制质量浓度（IC₅₀）为82.75 ng/mL,与其他几种常见的瘦肉精类药物的交叉反应率均小于0.9%,特异性良好。结论：通过戊二醛法成功合成了高免疫原性的CLO人工抗原,并获得敏感性高,特异性强的CLO鼠源多抗血清。     

三唑磷多克隆抗体的制备及鉴定

采用活泼酯法将三唑磷半抗原(TZPM-Hap)与牛血清蛋白(BSA)和卵血清蛋白(OVA)偶联,制备出免疫抗原(TZPM-A-BSA)和包被抗原(TZPM-A-OVA),经紫外扫描证明人工抗原合成成功.用免疫抗原TZPM-A-BSA免疫雌性Balb/c小鼠,获得了特异性的三唑磷多克隆抗体.以所获得的抗体建立间接竞争酶联...     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

1-芘丁酸人工抗原的制备及鉴定

为制备及鉴定1-芘丁酸（1-pyrenebutyric acid）人工抗原。采用碳化二亚胺（EDC）法将1-芘丁酸与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）进行偶联,合成人工免疫原PBA-BSA和人工检测抗原PBA-OVA;紫外扫描及SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示抗原制备成功;鼠源多抗血清的效价均已超过1 000,IC₅₀=14.31 ng/mL;与多环芳烃1-芘甲醇、1-芘甲醛、芘的交叉反应率小于14.40%,与菲、萘、苯并芘、BSA以及OVA交叉反应率均小于0.05%。作者成功制备出了PBA-BSA抗原,并且得到了敏感性良好的鼠源多抗血清,为后期单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立奠定基础。     

展青霉素人工抗原及多克隆抗体的研制

采用戊二酸酐法合成展青霉素-半戊二酸（PAT-HG），通过活泼酯法将PAT-HG偶联到牛血清白蛋白，制备了展青霉素免疫抗原（PAT—HG—BSA），免疫3只BALB／c小鼠，经4次免疫后，1号小鼠血清抗展青霉索抗体效价迭1：1600，且小鼠抗展青霉素多克隆抗体与展青霉素检测抗原的结合能被展青霉素阻断。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

丁草胺人工抗原及抗体制备研究

以除草剂丁草胺、巯基丙酸为原料,合成丁草胺半抗原,用氢核磁共振、电喷雾质谱、红外光谱方法进行鉴定;通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备丁草胺人工抗原,用紫外光谱法对其鉴定;免疫动物后,间接竞争ELISA检测鉴定抗体。结果表明,巯基丙酸与丁草胺连接生成半抗原,半抗原被连接到载体蛋白上,丁草胺人工抗原合成成功,获得了丁草胺小鼠抗血清。棋盘滴定法确定包被抗原工作浓度为3μg/ml,抗血清稀释倍数为32000倍。建立了间接竞争ELISA标准曲线,丁草胺IC50为1.44μg/ml,检测限为0.47μg/ml。     

卡巴氧的代谢物喹喔啉-2-羧酸人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

实验采用碳二亚胺法将卡巴氧代谢物喹喔啉-2-羧酸（QCA）与牛血清白蛋白（BSA）偶联,采用用混合酸酐法将其与卵清白蛋白（OVA）偶联,分别将其作为免疫原（QCA-BSA）和包被原（QCA-OVA）进行抗血清的制备及ELISA实验。经过多次动物免疫及EILSA实验,结果表明,获得了高效价的特异性抗体。