海产食品中致病性副溶血弧菌的基因检测

用PCR技术分析了六株从中毒病人食用剩下的海产食品及其粪便中分离出来的副溶血弧菌,发现这六株副溶血弧茵都含有tlh基因(扩增产物为368bp),其中五株含有tdh基因(扩增产物为250bp),但都不含trh基因,而且都为GS-PCR阴性.用碱性磷酸酶标记的tlh探针和tdh探针对这六株副溶血弧菌的tlh和tdh基因进行了进一步的鉴定,其结果与PCR结果相一致.然后采用随机引物扩增DNA多态性(RAPD)技术对六株tdh阳性菌进行了分析.     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌致病性方法的建立

目的 建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

水产品中致病性弧菌污染状况研究

目的了解水产品中致病性弧菌污染状况。方法采用实时荧光PCR方法对样品中的致病性弧菌进行初筛,阳性样品用传统培养法确证。结果检测了海产品、淡水水产品共12类1 356份样品,未检出致病性的O1群霍乱弧菌,但有非O1群霍乱弧菌存在;海产品的虾类、蟹类、贝类、软体类带副溶血性弧菌率高。结论珠海地区水产品中弧菌污染较为普遍,且存在着多重污染现象。     

水产品中创伤弧菌的快速检测与分离

目的:对水产品中创伤弧菌的快速检测与分离技术进行研究。方法:蛤蜊肉经高速匀浆处理后,在含有多粘菌数B的碱性蛋白胨水中增菌培养(35～37℃,12～16h),然后用PCR技术检测样品。PCR检测的目的基因是创伤弧菌的溶细胞毒素(hemolysin/cytolysin)基因,扩增产物为222bp。对PCR结果呈阳性的样品做原位杂交实验,用碱磷酶标记的寡核苷酸探针VVAP来分离创伤弧菌。通过对购买于青岛丹东路小市场的蛤蜊进行检验,分离出了2株创伤弧菌。结果表明:应用PCR、原位杂交技术能快速检测和分离水产品中存在的创伤弧菌。     

冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测方法研究

文章研发了一种可在16 h内完成冷冻水产品中副溶血性弧菌快速检测的方法。方法在首先完成样品的预增菌工作后,采用高温热裂解法与核酸亲和膜吸附法提取冷冻水产品等样品中的检材总DNA,设计副溶血性弧菌专一引物探针,运用实时荧光定量PCR技术扩增试样中副溶血性弧菌基因组保守基因片段,同时开展与国家标准方法的比对工作证实方法的可靠性,建立了特异性好、高检测通量的PCR检测方法。为验证所建立方法的适用性与稳定性,本研究从市场中随机抽取共331份冷冻水产品样品开展副溶血性弧菌的筛查检测,结果表明采用该方法在上述抽样调查的冷冻水产品中3份样品的副溶血性弧菌特异性的基因片段被扩增检验出,试样的目标菌检出率约为0.9%(3/331),该研究PCR方法的DNA检出限可达到0.01 ng/μL。     

2种弧菌的实时荧光PCR快速检测

目的为快速、特异、灵敏的检测致病性弧菌,建立致病性弧菌的实时荧光PCR方法。方法针对霍乱弧菌的种特异性基因ompW、毒力基因tcpA、ctxA和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光PCR检测方法。结果该方法能够特异性地检出副溶血性弧菌或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdh、tcpA或ctxA毒力基因,检测的灵敏度可达到10CFU/ml或0.1716μg/ml(pg/μl)DNA模板浓度。结论该方法特异性强、灵敏度高,适用于食品中致病性弧菌的快速检验。     

巢式PCR快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种世界范围性的食源性致病菌,食用了该菌污染的海产品可导致胃肠炎等疾病。为了建立一种可快速、特异地检测海产品中副溶血弧菌的方法,通过把副溶血弧菌基因组序列和其它不同种类弧菌的基因组序列进行比较分析,筛选出了一个副溶血弧菌特异性的标记基因-VP1331,根据该基因建立了副溶血弧菌的巢式PCR快速检测方法,并评估了其特异性、敏感性和稳定性。实验结果表明,该方法只有在以副溶血弧菌基因组DNA为模板时才能扩增出目的片段,而其它11种弧菌和非弧菌均不能扩增出目的片段。该方法的最低检测限为副溶血弧菌基因组DNA 10 fg、纯培养物6.6 CFU。人工污染实验表明,初始菌液浓度为25.7 CFU/100 mL时只需经过2 h的增菌培养即可检出。上述结果表明,VP1331基因可以作为副溶血弧菌种特异性标记,本方法可以用于污染海产品中该菌的检测与鉴定。     

双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法学研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)同时快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法。针对副溶血性弧菌tox R和霍乱弧菌omp W基因设计特异性引物,优化反应条件,建立水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测方法,并同时应用双重LAMP技术和PCR技术对实验菌株进行副溶血性弧菌和霍乱弧菌检测,比较两种方法的特异性和灵敏度。LAMP的最佳反应温度为61℃,在此条件下,双重LAMP检测技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌DNA的敏感度可达3.12 fg,且与其他常见的细菌株无交叉反应,特异性为100%;对模拟食品样品进行直接检测时检测限为50 cfu/m L;对60份水产样品进行检测时,6份样品出现LAMP及PCR阳性,而传统培养方法检测出4份阳性。实验结果表明所建立的双重LAMP技术在检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌时灵敏度、特异性高,时间成本低,适合于水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的快速检测。     

PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法研究

为了满足食品卫生快速反应体系的需要,提高水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的检测效率,本实验针对副溶血性弧菌特异性tl基因设计合成引物,采用酚-氯仿法提取DNA,利用大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)做方法特异性对照,建立了水产品中副溶血弧菌PCR快速检测方法。利用此方法对市场随机抽取的40份水产品进行检测,并用国家标准方法(GB/T4789.7—2003)对该方法的检验结果进行评价。结果表明:该方法操作简便,特异性强,菌液灵敏度为103CFU/ml,含菌量1～10CFU/g的样品经增菌6h后即可检出。与国标方法相比更加准确可靠,检测周期10h即可完成。说明此方法适合水产品中副溶血性弧菌的快速检测。     

水产品中副溶血性弧菌PMA-ddPCR活菌定量检测方法的研究

本研究旨在针对水产品中活的副溶血性弧菌建立一种快速定量的PCR检测方法。基于叠氮溴化丙锭(PMA)在一定光照条件下能抑制死亡菌DNA扩增,以及微滴式数字PCR技术能将检测精度扩展至单分子目标基因,并实现绝对定量的特点,以副溶血性弧菌tlh基因为目的片段设计及筛选适合的特异性引物与探针,优化反应体系,通过对PMA浓度及曝光条件等优化,建立了一种联用PMA-dd PCR技术快速检测水产品中活的副溶血性弧菌的定量检测方法。研究结果显示:选择16μg/m L作为PMA工作浓度,曝光时间为8 min,此条件下能够完全抑制副溶血性弧菌死菌的DNA扩增并对活菌扩增无影响。通过对比PMA-dd PCR和PMA-q PCR的检测低限分别为2×10~1 cfu/mL、2×10~2 cfu/mL,PMA-dd PCR法的灵敏度比PMA-q PCR法的高。应用PMA-dd PCR定量方法检测人工污染的基围虾和小帆立贝这两种海产品,在基围虾中最低可检出1.9×10~1 cfu/g的副溶血性弧菌、在小帆立贝中最低可检出8.9 cfu/g的副溶血性弧菌。该研究为将PCR技术实际应用于水产品中低量污染、活的副溶血性弧菌的定量检测奠定了基础。     

水产品中创伤弧菌ddPCR定量方法的建立

选取创伤弧菌单拷贝基因met为靶基因,设计引物探针,建立对创伤弧菌准确定量的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法,并进行特异性、灵敏度和重复性实验,同时与实时PCR(real-time PCR)方法进行比较。结果显示,所建立的ddPCR方法可以快速、高效地检测出创伤弧菌,细菌纯培养物中其定量限可达323拷贝数/mL,检测限可达61拷贝数/mL,人工污染牡蛎样品中能最低能检测到1.13×102拷贝数/g的目标菌。对人工污染样品中目标菌的检测,ddPCR的定量结果约为平板计数结果的1.4倍,比real-time PCR方法的检测更加稳定准确。本研究建立的ddPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测创伤弧菌。     

高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌

为建立一种快速鉴定副溶血性弧茵的HRM（高分辨率熔解曲线）real-timePCR法,以toxR为靶基因,结合特异性引物,通过优化反应体系及条件,进行特异性、敏感性及重复性评价,并初步应用于90份送检的鲜活海产品样本的检测。特异性试睑表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,Tm值为76．64±0．57℃;而与创伤弧菌、霍乱弧茵、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明,该方法最少可检测toxR重组质粒的浓度为3．50×102copies／mL。重复性试验表明,同一样品于试验内及试验问的平均Tm值分别为76．53±0．35℃和76．74±0．52℃,变异系数分别为0．56±0．42％和1．11±0．73％。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14．44%高至18．89％。本研究所建立的副溶血性弧菌HRMreal-ILrnePCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能应用于食品样本的检测,具有很好的研究价值和应用前景。     

Prevalence of Vibrio parahaemolyticus in seafoods and their processing environments as detected by duplex PCR

A duplex polymerase chain reaction (PCR) procedure targeting the genes gyrB and tl was established for specific identification of Vibrio parahaemolyticus from seafoods and processing environments. It could detect as few as 2.5 × 10² colony‐forming units mL^?1 in pure cultures. Direct detection of V. parahaemolyticus was also possible from artificially contaminated shrimp samples if combined with proteinase treatment. The homogeneous colonies on thiosulfate/citrate/bile salts/sucrose agar suspected to be V. parahaemolyticus or closely related species (n = 37) out of 259 samples of seafoods and processing environments were identified using the conventional method and duplex PCR. Both methods identified 17 isolates as V. parahaemolyticus from among the suspected isolates. Only one of the 17 V. parahaemolyticus isolates possessed the thermostable direct haemolysin gene (tdh) fragment as detected by different primer pairs in single PCR. Copyright © 2006 Society of Chemical Industry     

两种致病性弧菌二重LAMP-熔解曲线检测方法的建立

应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了食品中产毒素性霍乱弧菌和副溶血性弧菌二重LAMP-熔解曲线快速检测方法。本方法针对产毒素性霍乱弧菌ctx A基因和副溶血性弧菌gyr B基因分别设计引物组进行二重LAMP扩增,并利用熔解曲线法分析扩增产物,从而判断DNA模板中所含目标菌。应用本方法对9株目标菌和17株非目标菌的检测结果与预期一致,并可通过熔解曲线的特征峰准确分析DNA模板中所含目标菌。对二重LAMP扩增产物的测序分析表明,扩增所得序列与目的基因序列吻合,从而进一步验证了该方法的特异性。经测试,本方法对两种目标菌的检测灵敏度均可达100 fg DNA/反应管。实验证明所建立的方法具有良好的特异性,并可为食品中两种致病性弧菌的快速检测提供一种重要技术手段。