EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.     

牡蛎活性肽体外诱导HeLa细胞凋亡及其作用机制

采用复合酶法水解制备牡蛎活性肽,并运用Sephadex G-25柱层析法对酶解液中的肽类进行分离纯化与鉴定;以磺基罗丹明B(SRB)比色法,台盼蓝计数法,Hochest/PI双荧光染色法和DNA Ladder等检测牡蛎活性肽诱导HeLa细胞凋亡的方式,并采用流式细胞术和实时定量PCR分析牡蛎抗活性肽诱导HeLa细胞凋亡的作用机制。经分离纯化得到牡蛎活性肽(bioactive peptide of oyster,BPO),并测得其分子质量为751D;BPO能有效抑制HeLa细胞增殖,并阻止HeLa细胞G1期向S期的转换,促使凋亡基因表达上调。BPO的作用机制与诱导凋亡基因表达上调和细胞周期阻滞有关。     

无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用

无细胞蛋白表达通过细胞提取方式在体外合成安白纸,其实际遗传背景简单,便于上手操作,是生物研究中重要技术之一。在技术人员深入研究下,反应体系涉及到真核蛋白质合成,且提取蛋白质质量及效率大大提升,成本不断降低,反应规模达到百公升级。当下,无细胞蛋白表达在复杂蛋白、膜蛋白表达方面含有较大优势,在生物制药方面潜力巨大。以下,对无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用详细分析,旨在为发挥无细胞蛋白表达系统最大化优势奠定基础,促进生物制药工程长久发展。     

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的neo基因进行筛选,经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞,融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26 mg/L。利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现,融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中,而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性。利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现,筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性,表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞。     

三棱黄酮抗HeLa宫颈癌:降低分裂期细胞比率诱导细胞凋亡

目的:研究三棱的总黄酮(Rhizoma sparganii flavonoids,RSF)对HeLa宫颈癌细胞的毒理作用及其作用机制。方法:分别检测用含有质量浓度11.7～750μg/mL RSF的DMEM培养基培养时,组间HeLa细胞的增殖活性差异,通过免疫荧光技术、流式细胞术和核型分析方法分析RSF诱导HeLa细胞毒理的机制。结果:RSF含量高于188μg/mL的DMEM培养基可呈剂量性抑制HeLa细胞的增殖活性(P<0.01)、增加细胞凋亡小体的比率(P<0.01);与1%甲醇对照组相比,RSF-375(RSF含量为375μg/mL)与RSF-750(RSF含量为750μg/mL)药物组HeLa细胞的分裂(M)期细胞比率显著下降(P<0.01),细胞间的接触生长状态消失,体积增大;在本次实验中,RSF-375与RSF-750药物组HeLa细胞微管(a-tublin)细胞骨架形态的特异性免疫结果与对照组相比,细胞形态呈显著不规则状改变,微丝突触增多,表现为较高的迁移运动趋势。结论:RSF是三棱抗HeLa宫颈癌的有效成分,在本实验中,RSF可以通过干扰细胞有丝分裂相关的机制显著抑制HeLa细胞的增殖活性(P...     

Monellin-EGFP 融合蛋白在毕赤酵母中的表达

根据已报道的Monellin甜蛋白氨基酸序列,结合毕赤酵母与桑树密码子的偏好性,人工设计合成单链monellin基因,并与增强型绿色荧光蛋白EGFP基因连接,构建融合表达载体。采用电击转化法成功将表达载体导入毕赤酵母GS115中,并获得高效表达的重组子pPIC9K-M-E。经PCR检测,SDS-PAGE和Western Blot杂交证实已表达出融合蛋白,该蛋白经纯化与盲测实验,结果显示其甜度约为标准蔗糖的500倍。     

珠母贝糖胺聚糖PG-Ⅱ诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的:探讨珠母贝糖胺聚糖PG-II诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡,从而抑制其增殖。方法:MTT法检测珠母贝糖胺聚糖PG-II对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用。倒置显微镜、荧光显微镜观察HeLa细胞凋亡的形态学特征,琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂片段,流式细胞仪定量检测细胞凋亡的百分率及对其细胞周期的影响。结果:MTT法显示PG-II可抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖。倒置显微镜和荧光显微镜形态学观察可见HeLa细胞凋亡的形态明显变化。琼脂糖凝胶电泳显示PG-II作用HeLa细胞24h,出现分子质量为200bp到2000bp不等的细胞凋亡的特征性DNA梯状条带。流式细胞术测试表明:PG-II可使HeLa细胞阻滞于G1期,剂量为100mg/L作用24h阻滞作用最明显,凋亡指数为42.6%。结论:珠母贝糖胺聚糖PG-II可能通过诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡而抑制其增殖。     

青钱柳多糖对人宫颈癌HeLa细胞和人脐带内皮细胞生长的影响

目的:研究青钱柳多糖(polysaccharides isolated from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskjk,PCP)对人宫颈癌HeLa细胞和人脐带内皮细胞(HUVEC)生长的影响。方法:采用噻唑蓝(MTT)法,观察不同浓度、不同提取方法获得的PCP对HeLa细胞和HUVEC细胞生长的影响。结果:PCP I、II在50、100、200、400μg/ml浓度条件下,均可极显著性抑制HeLa细胞生长(p<0.01)。PCP I、II对HUVEC细胞生长有一定影响,但增殖抑制率不高;在PCP抑癌作用最高的浓度处(200μg/ml),PCP对HUVEC细胞的生长没有影响。结论:PCP极显著性抑制HeLa细胞的生长;在P C P抑癌作用最高的浓度处,P C P对H U V E C细胞的生长没有影响。     

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。     

融合蛋白IFN-IgG Fc在乳酸乳杆菌中的表达及其生物学活性研究

用乳酸菌表达有药用价值的生物学活性多肽,是当前国际上的研究热点之,对开发新的功能性食品具有广阔的前景.本文应用PCR方法将人干扰素IFN-α-2b基因与IgG Fc基因连接,并引入一段柔性连接肽,构建了融合蛋白基因IFN-IgG Fc,将融合蛋白基因克隆到原核表达载体pSC111 AE中,转化乳酸乳杆菌ATCC393进行诱导表达及鉴定,并研究了融合蛋白的生物学活性.结果表明,通过Western-Blot方法在表达上清液检测出干扰素融合蛋白,ELISA测定表明两段多肽能够保持各自的构象,基因工程乳酸菌表达的上清液可以诱导WISH细胞产生明显的抗VSV病毒的活性,其活性为1.71×103IU/ml.本文首次构建并在大肠杆菌和乳酸菌表达了IFN-IgG Fc融合蛋白,获得了能产生人干扰素的乳酸菌株,为基因工程乳酸菌及相关药物的开发研究奠定了基础.     

白花蛇舌草对肿瘤细胞信号传导通路的抑制

研究了白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）提取物对肿瘤细胞信号传导通路的影响。首先采取四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）法测定各提取物对体外培养人宫颈癌细胞株HeLa增殖的抑制；进一步通过免疫印迹法分析了各提取物对EGF介导的Erk信号传导通路中Erk1／2蛋白磷酸化的影响。结果显示，煎煮及冷水提取物对HeLa细胞的增殖均有抑制，但两者无显著差别，而乙醇提取物显著抑制HeLa细胞增殖。对EGF介导Erk信号传导通路的影响显示。白花蛇舌苹提取物处理细胞90min后，EGF诱导的Erk1/2磷酸化水平显著降低，且表现浓度依赖性。抑制效果：乙醇提取物〉冷水提取物〉煎煮提取物。研究证明。中药白花蛇舌草含有信号传导通路抑制剂，可能在抗肿瘤过程中发挥重要作用。     

重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBP-PAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。     

重组牛乳铁素融合表达质粒的构建及其抑菌活性分析

为建立生物合成牛乳铁素的方法,根据牛乳铁素氨基酸序列确定其编码序列,利用PCR 技术获得基因扩增产物,接着将该产物与编码鱼腥蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120 的DNA 聚合酶基因dnaENI 中断裂的内含肽基因Asp dnaEIn 的PCR 产物进行重组PCR,将获得的重组融合基因再克隆到表达载体pET-28a 构建重组融合表达质粒。结果显示,融合表达质粒转化大肠杆菌后经诱导能在大肠杆菌表达宿主Escherichia.coli BL21(DE3) 中大量表达,且细胞裂解液与纯化的Anabaena sp. PCC 7120中含断裂内含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反应后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。     

美拉德反应对乳清分离蛋白及其水解物抗氧化性的影响

以乳清分离蛋白及其蛋白水解物为原料分别与半乳糖发生美拉德反应,研究两者美拉德反应的褐变程度、接枝度及产物荧光光谱的变化,同时以乳清分离蛋白和蛋白水解物作对照,研究两者美拉德反应产物的抗氧化性。结果表明:乳清分离蛋白及其水解物美拉德反应的褐变程度、接枝度及产物的抗氧化性均在4 h达到最大。其中,乳清分离蛋白及其水解物与半乳糖美拉德反应的褐变程度和接枝度最大值分别为1.114、18.431%和1.413、28.273%;两者美拉德反应产物的还原力、2,2’-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除能力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力分别为0.605、46.29%、61.77%和0.923、69.81%、78.43%,均显著高于对照组(P0.05)。同时,内源荧光光谱发现,美拉德反应改变了乳清分离蛋白及其水解物的构象,使二者的结构更加松散。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

冬凌草甲素诱导小鼠肝癌细胞醌还原酶活性及其机理研究

为筛选鉴定出溪黄草中抗癌活性组分,本研究以溪黄草为材料得到乙酸乙酯提取物,通过硅胶柱层析、半制备色谱分离纯化,利用小鼠肝癌细胞Hepa1c1c7体外模型测定分离产物对细胞存活率和醌还原酶(quinone reductase,QR/NAD(P)H:reductase 1,NQO1)诱导活性。通过核磁共振、质谱分析鉴定组分结构;采用细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)p38、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)5种蛋白激酶的特异性抑制剂,确定冬凌草甲素诱导QR活性的信号转导通路,采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)和Western blot法分别检测NQO1的m RNA和蛋白表达情况。结果:1)从溪黄草中筛选鉴定出一较强诱导QR活性组分为冬凌草甲素;2)冬凌草甲素质量浓度为0.94μg/m L时,即可诱导QR活性倍增;3)PI3K抑制剂处理显著抑制冬凌草甲素诱导的QR活性,而ERK抑制剂处理显著促进冬凌草甲素诱导的QR活性,但PKC、p38和JNK抑制剂处理对冬凌草甲素诱导的QR活性无明显影响;4)冬凌草甲素显著提高细胞内NQO1的m RNA和蛋白表达水平。结论:溪黄草中的冬凌草甲素具有抗癌活性,其抗癌活性通过提高Hepa1c1c7细胞中NQO1基因的转录及翻译水平以增加QR活性实现,并且其抗癌功能主要通过激活PI3K通路、抑制ERK通路进行信号传导。研究结果为深入开展溪黄草和冬凌草甲素的癌症化学预防研究奠定前期理论基础。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

鲨鱼单域抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达及热稳定性分析

酶标抗体的稳定性对酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)至关重要,但常规化学偶联方法制备的酶标抗体具有热稳定性不足的缺点,这限制了酶标抗体在ELISA中的应用。本研究利用基因工程技术克隆表达出碱性磷酸酶与特异性鲨鱼单域抗体的融合蛋白,并对融合蛋白的亲和力和热稳定性进行了研究。结果表明:在16 ℃下,0.05 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导可实现融合蛋白的可溶性表达,表达出的融合蛋白分子量约为63 kDa,与目标抗原的亲和常数可达7.80×10^-8 mol/L,具有良好的抗原结合能力;融合蛋白在58 ℃处理180 min后热稳定性良好,证明该融合蛋白可以作为ELISA检测中一种潜在的免疫诊断剂。

     

地皮菜中一种新型水应激蛋白基因的克隆表达及其抗人结肠癌细胞SW480的作用

利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增出地皮菜（Nostoc commune Vauch.）一种新型水应激蛋白（water stress protein,WSP）的基因（GenBank 序列号：KF003026）,连接到原核表达载体pET28a上,测序鉴定后转化入大肠杆菌BL21,获得一种新型水应激蛋白表达工程菌;经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达及镍离子亲和层析柱（Ni-NTA）纯化后,得到了带6×His标签、分子质量大小为40 kD的可溶性目的蛋白,称其为重组水应激蛋白1（recombinant water stress protein 1,Re-WSP1）。细胞增殖抑制实验结果表明,Re-WSP1蛋白可以抑制结肠癌细胞SW480的增殖,而对正常结肠上皮FHC细胞无明显作用;DAPI细胞核染色结果表明,该蛋白能够诱导SW480细胞凋亡小体的形成;Western blotting结果显示,Re-WSP1蛋白能够促进Procaspase-3和Procaspase-8的活化剪切。以上结果表明：Re-WSP1蛋白能够明显的抑制结肠癌SW480细胞的增殖,并可能通过Caspase依赖途径诱导SW480细胞凋亡。