绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞的超微结构特征

背景:研究表明,绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞免疫学表型、细胞周期、分化潜能等均未发生明显改变。目的:进一步观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞超微结构的影响。方法:分离培养成人骨髓间充质干细胞,抗CD34、抗CD105免疫细胞化学染色鉴定,选第3代细胞进行绿色荧光蛋白标记,超薄切片后用透射电镜观察细胞超微结构,以未经绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞为对照。结果与结论:骨髓间充质干细胞表达CD105,不表达CD34。绿色荧光蛋白标记后,骨髓间充质干细胞细胞质发出绿色荧光,绿色荧光主要集中于细胞核周围的胞浆内,远离细胞核的胞浆内荧光强度逐渐减弱。相对于未标记的骨髓间充质细胞,经绿色荧光蛋白标记后细胞粗面内质网、高尔基体等细胞器较多,而线粒体相对较少;另外,脂滴和空泡样结构也多一些。结果证实绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞性状的影响较为局限,是一种较为理想的细胞标记示踪剂。     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

绿色荧光蛋白标记对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响

目的：观察腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞的标记效率及标记对骨髓间充质干细胞生长的影响，为进一步追踪研究骨髓间充质干细胞奠定基础。 方法：实验于2006—11/2007—03在四川大学华西组织胚胎学与神经生物学实验室完成。①实验材料：成年雄性SD大鼠，体质量100～120g，由四川大学实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞，传代扩增，应用免疫细胞化学方法对培养的骨髓间充质干细胞进行鉴定。将生长到约80％融合的第3代骨髓间充质干细胞随机分为绿色荧光蛋白标记组和对照组。绿色荧光蛋白标记组加入1：100稀释的腺病毒（咿dEasy-1-pAdTrack-CMV）上清液，对照组加入磷酸盐缓冲液。③实验评估：观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响。 结果：体外培养的原代骨髓间充质干细胞24h内可见有少量贴壁细胞，8～10d左右达到70％～80％汇合。免疫细胞化学检测第3代骨髓间充质干细胞显示，CD44和CD90表达阳性，而CD14和CD34表达阴性。生长曲线表明，绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞增殖无明显影响。 结论：腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞效率高，标记后对细胞的生长无明显影响。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验

背景:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,把干细胞和基因治疗结合起来是研究中枢神经系统损伤和肿瘤治疗新的思路和趋势.目的:观察腺病毒载体绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP)在兔骨髓问充质干细胞转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰骨髓间充质干细胞的可行性.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-08/2009-03在南方医科大学完成.材料:新西兰大白兔,雌雄不拘,质量2.0-3.0 kg.方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad.GFP(1×10~3～1×10~(10)PFU/mL)转染骨髓间充质干细胞,细胞计数法分析转染率.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导感染Ad-GFPBMSCs向神经样细胞的定向分化.结果:3-6代骨髓间充质干细胞表面标志CD34、CD45阴性,而CD29、CD44阳性.当病毒滴度为1×10~7PFU/mL时感染率为55%,1×10~9,1 ×10~(10)PFU/mL感染率均为85%,但1×10~(10)PFU/mL时出现细胞病理现象,7 d荧光表达最强,28 d仍可见荧光表达.感染Ad-GFP的骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶表达阳性.结论:合适滴度的Ad-GFP可以高效感染骨髓间充质干细胞,对细胞的生物学特性影响较小,不影响诱导分化功能,骨髓间充质干细胞可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞.     

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景:小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.目的:观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成.材料:C57BU6小鼠4～6周龄.体质量20g,雌雄不拘.方法:通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞.参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%.用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块.然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×10~6/cm~2浓度接种75 cm~2培养瓶.对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-Dil标记.主要观察指标:原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度.结果:①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形,多角形和扁平形.3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状.②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45.③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构.在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒.④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-Dil标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上.流式细胞仪检测CM-Dil细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞.结论:改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-Dil标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪.     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.     

绿色荧光蛋白基因转染人骨髓间充质干细胞体外成脂肪诱导分化的研究

目的以逆病毒为载体将绿色荧光蛋白基因（EGFP）转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）,研究对其成脂肪诱导分化的影响。方法以逆病毒为载体将EGFP基因转染hMSC,流式细胞仪检测转染后hMSC的表面标记,并对转染EGFP的hMSC进行成脂肪诱导分化培养。结果转EGFP基因的hMSC/EGFP细胞与未转基因的hMSC在细胞形态及生长特点上无差异。转基因的hMSC细胞仍高表达CD29、CD44、CD105抗原,传代培养后可诱导形成脂肪细胞。结论转染EGFP基因对hMSC在体外成脂肪诱导能力无明显影响,EGF可以作为研究hMSC多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×108TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高（P〈0.05）,MOI值为10的组能获得〉70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

DiO标记对人骨髓间充质干细胞生物学功能的影响

目的用细胞膜绿色荧光探针Di O标记人骨髓间充质干细胞(h BMMSCs),探讨其对h BMMSCs生物学功能的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离、培养h BMMSCs;流式细胞术检测Di O对h BMMSCs的标记效率;通过Transwell迁移实验、平板克隆实验、生长曲线分析、成脂及成骨诱导实验分别检测Di O对h BMMSCs迁移、增殖和多向分化能力的影响。结果Di O对h BMMSC的标记效率可达(99.5±0.4)%;Transwell迁移实验、平板克隆实验、生长曲线分析、成脂及成骨诱导实验结果表明,与未标记h BMMSCs相比,标记后的h BMMSCs迁移、增殖及成脂、成骨分化能力未见明显改变,差异均无统计学意义(P均0.05)。结论经Di O处理未见明显影响h BMMSCs的生物学功能,可做为安全、有效的h BMMSCs体外标记绿色荧光染料。     

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定

背景：转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白,与传统病毒、质粒转染相比,能在活细胞中稳定地表达,可较快筛选其修饰的细胞。目的：观察绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法：取2周龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠双侧长骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。流式细胞术分析第5代绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞的细胞表型,并分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向诱导分化,采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。结果与结论：成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表达 CD90和CD105,不表达或弱表达CD14和CD45。经成骨诱导3周后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积,经成脂诱导3周后油红O染色见红色的脂滴。结果表明稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,可作为良好的示踪因子。     

骨性材料复合绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞研究体系的建立与应用术

背景:由于骨性生物材料和骨组织本身坚硬致密的物理特性,限制了对生长在其中的靶细胞的示踪研究.目的:针对骨性材料含钙、透光性差的特性,拟建立骨性材料复合绿色荧光蛋白基因标记的骨髓问充质干细胞的研究体系.设计、时间及地点:体外观察实验,于2008-06/2009-01在南方医科大学南方医院骨与软骨再生医学重点实验室完成.材料:β磷酸三钙多孔骨性生物支架材料(1 cm×1 cmx0.8cm)购自上海贝奥路生物材料有限公司.3月龄新西兰大白兔用于获取并培养骨髓间充质干细胞.方法:①骨髓间充质干细胞以携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记后,接种于β-磷酸三钙骨性生物支架材料内部.②以荧光倒置显微镜观测材料中细胞的生长情况,并通过荧光定量聚合酶链反应等检测材料内部细胞的增殖情况.③以自创的半固体脱钙体系对复合细胞的材料脱钙后.制备连续冰冻切片观察;同时,采用不脱钙塑料包埋、扫描电镜等方法观察.主要观察指标:骨性材料中绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞的分布、形态及增殖情况.结果:①荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞在材料内部生长、增殖.②普通聚合酶链反应可对材料内的绿色荧光细胞进行定性分析,荧光定量聚台酶链反应检测的Ct值和接种的绿色荧光细胞数量呈指数相关,故可以对材料中的绿色荧光细胞进行定量分析.③半固体脱钙可使骨性材料内部坚硬的钙质成分消失,而细胞所在的位置,形态和荧光不变;不脱钙塑料包埋可以原位保留细胞形态和荧光,但仅适用于小块组织;而扫描电镜观察范围有限,细胞无法保留荧光.结论:建立了可在骨性材料内部疗便、直观地追踪绿色荧光蛋白标记骨髓闻充质干细胞的体系,具有广泛的应用前景.     

梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染效果

目的:梭华-Sofast是新一代阳离子聚合物转染试剂,具有高效率转染所必备特征,如浓缩DNA,将DNA运送到细胞内,并使其在细胞核内释放等,且细胞毒性很低,很稳定,不被血清清除等特点.观察梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞的转染效果及细胞毒性.方法:实验于2006-03-01/12-31在福建医科大学神经生物学研究中心完成.①实验材料:实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠10只,二三月龄,体质量150～250 g,由福建医科大学实验动物中心提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:SD大鼠10只,用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,分别以Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000为转染试剂,转染绿色荧光蛋白入骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的绿色荧光蛋白基因表达,并通过MTT法检测转染细胞毒性.结果:梭华-Sofast、阳离子聚合物Jet PEI、Superfect和阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的绿色荧光蛋白能有效转染入骨髓间充质干细胞,转染效率分别为(85.62±8.76 )%、(73.34±7.32)%、(75.61±7.79)%和(76.62±8.21)%,梭华-Sofast转染率最高(P < 0.05);转染细胞的存活分数分别为(92.18±9.27)%、(86.98±8.54)%,(87.84±8.59)%和(87.17±8.61)%,梭华-Sofast细胞毒性最低(P < 0.05).结论:梭华-Sofast介导绿色荧光蛋白转染骨髓间充质干细胞具有高转染效率和低细胞毒性的优点.     

绿色荧光蛋白转染大鼠骨髓间充质干细胞及体外向神经元样细胞的分化

背景:成年骨髓间充质干细胞诱导后在体外可分化为神经元样细胞,利用细胞转染技术让其表达绿色荧光蛋白,便于在动物模型体内跟踪观察。目的:观察增强型绿色荧光蛋白转染的骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞的能力,拟为增强型绿色荧光蛋白基因作标志物对外源性骨髓间充质干细胞进行体内追踪做准备。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在中国医科大学医学分子生物学国家重点实验室完成。材料:清洁级成年Wistar大鼠32只,由中国医科大学实验动物部提供。增强型绿色荧光蛋白质粒为Sigma公司产品。方法:取大鼠两侧股骨及胫骨,Percoll密度梯度离心 贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞,达90%融合后消化传代扩增。由脂质体介导,将含有增强型绿色荧光蛋白质粒cDNA转入骨髓间充质干细胞,经G418筛选后,按0.4×109L-1接种,加入含FBS、碱性成纤维细胞生长因子的DMEM预诱导24h,更换培养液后再以含BHA、DMSO的无血清DMEM诱导5h～6d。主要观察指标:荧光显微镜观察细胞转染情况,免疫细胞化学染色检测转染细胞诱导后神经元表面抗原的表达。结果:携带增强型绿色荧光蛋白基因的骨髓间充质干细胞生长旺盛,转染24h后在细胞核中就可见弥散绿色荧光,转染48h后绿色荧光更加集中,在细胞核中聚集成团块、颗粒状,体外培养3个月后仍能够高水平表达增强型绿色荧光蛋白。与未转染细胞比较,转染细胞诱导后其神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、巢蛋白阳性率均无明显变化(P>0.05),胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达。结论:骨髓间充质干细胞体内能稳定、高效和持久地表达增强型绿色荧光蛋白,转染后生物学性状未发生改变,体外在细胞因子和氧化剂的诱导作用下仍可以分化为神经元样细胞。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力

目的:研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymastemcells,MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力,为血管组织工程在体研究提供实验依据。方法:实验于2003-10/2004-10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成。无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓,用直接贴壁法获得小鼠MSCs,然后以血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)进行诱导分化,最后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrandfactor,vWF)免疫荧光鉴定观察。结果:MSCs每扩增一代,细胞数量增加4～8倍,7.0×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.4×108个细胞。在70%～80%融合时呈现“铺路石”样形态,说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同。添加VEGF诱导2周后,以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现,诱导组的vWF呈阳性表达,对照组vWF表达呈阴性。结论:绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强,在VEGF作用下可以向内皮细胞转化。