Survivin靶向的短发夹RNA表达载体的构建

目的：构建存活素（Survivin）基因短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）重组质粒并测序鉴定,为下一步探索乳腺癌基因治疗的RNA干扰途径建立基础。方法：设计并合成有小发夹结构的8条DNA片段,退火成互补双链后克隆至pSilencer adeno 1．0-CMV载体中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5。菌株,提取质粒行酶切鉴定后测序分析。结果：酶切鉴定和测序结果证实构建成功。结论：survivin shRNA重组质粒的成功构建为下一步用腺病毒包装,并感染荷瘤裸鼠行靶向RNA干扰抗乳腺癌的研究打下基础。     

MBD2靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以MBD2(methyl CpG-binding domain 2)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论 MBD2靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中MBD2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和序列分析

目的 利用pgenesil-1质粒载体,以bcl-2为靶基因,设计构建重组体,以用于后继的RNA干扰研究.方法 设计3对有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切电泳鉴定后,进行测序分析.结果 将合成的DNA片段退火后克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的 序列.结论 靶向bcl-2基因转录shRNA的重组质粒可以在体外成功构建,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中bcl-2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.     

DNMT1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的:本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法:设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:DNMT1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰DNMT1的mRNA转录,从而达到治疗肿瘤的目的.     

PYK_2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响。方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定。用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Westernblot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况。结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组。结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用。     

PYK2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响.方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定.用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况.结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组.结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用.     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向Survivin基因及CDKl基因的短发夹样RNA（Short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDKl序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDKl基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及基因测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shR-NA-Survivin-U6-shRNA—CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。结论成功构建Survivin基因及CDKl基因联合靶向shRNA重组质粒,为进一步研究Survivin基因和CDKl基因联合干扰提供了新的方法。     

小鼠线粒体ATP8基因RNA干扰载体构建

目的:构建ATP合成酶亚基8(ATP8) 基因的RNA干扰载体.方法:应用小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)法表达构建ATP8的RNA干扰载体,重组质粒经BamH I和EcoR I酶切鉴定;选择其中单个克隆进行单向测序鉴定.结果:重组质粒DNA能被BamH I切开而不能被EcoR I酶切,所提质粒为阳性重组载体;测序鉴定结果与设计的shRNA完全一致.结论:成功构建了pGPH1/GFP/ Neo-mouse-shATP8 RNA干扰质粒,为下一步进行ATP8基因RNA干扰在卵母细胞发育成熟中的作用奠定基础.     

HnPNPB1基因短发夹环RNA载体的构建与鉴定

目的 利用RNA干扰（RNA interfering，RNAi）技术，构建HnRNPB1表达载体，并进行鉴定。方法 采用H1启动子，分别把被7bP序列间隔的21bp长短的HnRNPB1靶序列的反向重复序列，置于PsiRNA-hH1neoG2质粒中，分别构建HnRNPB1短发夹环RNA（shRNA），产生重组质粒PSiRNA—hHl neoG2 HnRNPB1。结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，并作测序分析，经测序鉴定确定为所需序列。结论 针对HnRNPB1基因的特异性ShRNA真核表达载体PSiR—NA—hH1 neoG2 HnRNPB1的成功构建，为进一步研究其基因功能打下基础。     

CXCR4短发夹shRNA表达质粒的构建

目的构建趋化因子受体CXCR4shRNA质粒重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法设计有小发夹结构的两条DNA序列.经退火成互补双链,再克隆至Psilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果成功构建了CXCR4hRNA质粒重组体.结论CXCR4 shRNA质粒重组体的成功构建为研究CXCR4靶向RNA干扰抗肿瘤的作用打下基础.     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及克隆

目的：构建弓形棒状体蛋白2（ROP2)基因重组质粒。方法：根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，经酶切及PCR鉴定，而后进行测序。结果：ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论：在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因，为下一步弓形虫诊断及疫苗研究打下了基础。     

介导人血红素加氧酶-1基因的重组腺相关病毒载体的构建

目的:构建含人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定。方法:利用基因重组技术,采用限制性内切酶HindⅢ从质粒XM-6/hHO-1中将目的基因hHO-1基因片段切出,克隆到质粒PAAV-MCS的HindⅢ位点中,构建重组质粒pAAV-hHO-1,采用限制性内切酶酶切,PCR和DNA测序鉴定。结果:PCR扩增出1 317 bp大小的片段,酶切鉴定证实插入位点及方向与预期的完全一致;测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致。结论:成功构建了含hHO-1基因的重组腺相关病毒载体,为缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）溶血素A（hemolysin A,HLYA）hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5aЭ感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与己知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.     

表达UGT1A1重组腺相关病毒载体的构建

目的 获得表达胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶（UGT1A1）基因；构建UGT1A1重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HepG2细胞总RNA中扩增UGT1A1基因，最终连接于pAAV—MCS．双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒。并在HEK293T细胞表达，制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了人类UGT1A1基因．构建表达UGT1A1基因重组腺相关病毒载体。并成功表达于HEK293T细胞。结论 本实验构建的人类UGT1A1重组腺相关病毒将为因UGT1A1活性不足导致的高胆红素血症的基因治疗奠定基础。