Molecular Cloning and Preliminary Analysis of Clmk-1 Gene in Cochliobolus lunatus

谷子弯孢病菌(Cochliobolus lunatus)为谷子上重要的叶部病害,发生严重时会影响谷子的产量及品质.为了解MAPK级联途径在谷子弯孢病菌发育及致病性中的作用,根据已知植物病原真菌MAPK基因的保守结构域设计简并引物,通过PCR扩增法获得了谷子弯孢病菌MAPK基因的同源片段,并利用RACE技术获得了基因的全长cDNA 序列,该基因命名为Clmk-1.Clmk-1基因开放阅读框为1065bp,编码354个氨基酸,并且含有MAPK基因的保守的TGY和CD基序.聚类分析结果表明,谷子弯孢病菌Clmk-1基因与其他植物病原真菌Hog1类似MAPK基因的同源性很高.利用Promoterscan软件发现,Clmk-1基因启动子区含有热激转录因子(HSF)、ADR转录因子和GCR转录因子的结合元件.MAPK途径特异性抑制剂U0126抑制谷子弯孢的孢子萌发及芽管发育.研究初步表明,Clmk-1基因为Hog1类似MAPK基因,可能与渗透胁迫相关,并且MAPK级联途径参与病菌孢子萌发及芽管形态建成.克隆的Clmk-1基因为进一步研究谷子弯孢病菌MAPK基因的功能奠定基础.     

粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶基因克隆及表达分析

粟弯孢霉叶斑病为谷子重要的叶部病害，为了解钙调磷酸酶信号途径在粟弯孢霉叶斑病菌中的功能，对粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶基因进行了克隆和初步分析。通过简并PCR法扩增获得了粟弯孢霉叶斑病菌钙调磷酸酶催化亚基ClCna和调节亚基ClCnb基因的同源片段，并利用RACE技术获得了ClCna和ClCnb基因序列同源片段的全长cDNA序列。粟弯孢霉叶斑病菌ClCna和ClCnb基因编码的蛋白与其他病原真菌钙调磷酸酶蛋白具有很高的同源性，ClCna基因编码的蛋白含有钙调素结合位点、钙调磷酸酶调节亚基结合位点和自身抑制调节位点，而ClCnb基因编码的蛋白含有4个钙离子结合位点。利用钙调磷酸酶特异性抑制剂环孢素A处理粟弯孢霉叶斑病菌分生孢子，发现分生孢子的萌发率明显下降。利用实时荧光定量PCR方法分析粟弯孢霉叶斑病菌中ClCna和ClCnb基因在非生物胁迫下的表达模式，在山梨醇和氯化钠胁迫下都是诱导表达，因此，推测这2个基因可能在粟弯孢霉叶斑病菌的逆境胁迫及孢子萌发中起重要的作用。     

谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应

谷子白发病是谷子生产上的重要病害,可严重影响谷子的产量和品质。WRKY转录因子广泛参与植物的抗病,生长发育等多种生理过程。为了探究谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应,进而发掘谷子特有的抗病基因并为以后的抗病研究提供参考,本研究以感病品种‘晋谷21’为试材,基于前期对转录组测序的基础上,筛选出8个与谷子白发病相关的WRKY转录因子基因,然后通过生物信息学技术,对这8个WRKY转录因子基因特征,基因序列及所在染色体位置,基因组结构模式启动子序列元件,与白发病菌相关的调控元件以及表达模式等进行了分析。研究发现,8个WRKY转录因子基因中5个基因分布在5号染色体上,在受白发病菌胁迫后其表达水平存在显著差异。启动子顺式元件分析的组成和分布也存在较大差异,8个基因的蛋白大小是202~440个氨基酸,系统进化树分析表明,基因Seita.8G123100,Seita.5G261700的亲缘关系较近,并且受侵染后的表达水平均高于正常水平。发现8个基因中5个基因在受到病原菌侵染时其表达水平高于其正常状态下的基因表达水平,可以作为谷子抗病的重要候选基因。本研究结果为后续筛选谷子抗病基因及谷子抗病机制的研究奠定了一定的理论基础。     

玉米弯孢病病原菌ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为了对玉米弯孢病菌的鉴定、区域发生关系以及遗传多样性等进行研究,采用单因素试验优化玉米弯孢叶斑病菌ISSR-PCR反应体系中模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶、Mg~(2+)的用量,并确定每条引物的最佳退火温度。结果表明,最佳反应体系为:模板DNA 1.6μL(25 ng/μL)、引物1.4μL(5μmol/L)、dNTPs 0.25μL(2.5 mmol/L)、Taq酶0.4μL(2.5 U/μL)、Mg~(2+)0.8μL(25 mmol/L)、10×Taq Buffer 2μL、dd H2O 13.55μL。在该体系下选用3个玉米弯孢病菌的全基因组DNA,分别对52条ISSR引物进行筛选,筛选出16条多态性高、扩增稳定的ISSR引物。玉米弯孢病菌ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术对该病原菌进行遗传分析奠定了基础。     

谷子谷瘟病防治措施

<正>谷瘟病的病原菌为灰梨孢菌,属半知菌亚门梨胞菌属真菌。在我国谷子产区普遍发生,是谷子的重要气传流行性病害。近年来由于推广的品种抗性较差,在部分地区危害有逐年加重趋势。1.病害特征谷子各生育期均能发病,可侵害谷子叶片、叶鞘、节、穗颈、穗轴或穗梗等部位,引起叶瘟、穗颈瘟、穗瘟等不同症状,其中叶瘟、穗瘟发生普遍且危害严重。叶瘟:谷子苗期即可发病,病菌侵染叶片,先出现椭圆形暗褐色水渍状小斑点,以后发展成梭形斑,中央灰白色,边缘褐色,部     

谷子角质合成基因对干旱胁迫的响应

干旱是影响谷子产量的重要因素,以抗旱性强的谷子品种赤谷16（M79）及其母本赤谷10号（E1）,父本承谷8号（H1）作为研究材料,采用苗期自然干旱处理并设置对照,在干旱处理第6天（土壤水分含量约为20%）时取叶片进行转录组测序。用ExPASY分析基因的理化性质,GSDS 2.0分析基因结构,MAGA 7.0构建系统进化树,TMHMM Server v. 2.0预测跨膜结构域,SOPMA预测蛋白的二级结构。结果显示8个谷子角质合成基因编码的蛋白均为亲水性蛋白,且均为酸性;经干旱胁迫处理之后,M79、E1和H1中8个基因的表达变化趋势有所不同,Seita.8G128800和Seita.7G197000表达明显上调;8个基因中有4个基因与玉米的基因具有同源性,有3个基因与水稻的基因具有同源性,编码蛋白部分有跨膜结构域。角质合成基因在谷子响应干旱胁迫过程中发挥作用,其调控机理较为复杂。本研究的结果为进一步探讨谷子角质与抗旱的关系提供了一定理论依据。     

阿魏氯仿提取物对7种玉米病害的离体抑菌活性比较

采用生长速率法和孢子萌发法测定了阿魏氯仿提取物对引起玉米病害的7种病原菌(小斑病菌、弯孢霉叶斑病菌、链格孢叶斑病病菌、圆斑病菌、顶腐病菌、青枯病菌和瘤黑粉病菌)的菌丝生长和孢子萌发的影响。结果表明,对于同一种病原菌来说,阿魏氯仿提取物对其菌丝生长的抑制效果好于对其孢子萌发的抑制效果;对顶腐病菌菌丝生长的抑制效果最好,EC50只有46.66 mg/L;可引起大中型分生孢子畸形。     

谷瘟病菌无毒基因PWL家族检测及变异分析

为了确定不同地区谷瘟病菌群体中无毒基因PWL家族的分布和变异情况,从全国谷子主产区的不同区域采集分离了252株谷瘟病菌单孢菌株,提取基因组DNA,参考目前已知稻瘟病菌中无毒基因PWL家族的核苷酸序列开发合成了5对引物,通过PCR扩增对252株谷瘟病菌进行PWL家族基因检测,并对扩增片段进行测序分析。结果表明,252个谷瘟病菌菌株都不包含PWL1基因,65个菌株包含出PWL2基因,扩增率25.8%,252个菌株都包含PWL3与PWL4基因,扩增率100%。谷瘟病菌PWL3基因与稻瘟病菌中同源基因相比,在基因编码区存在849 bp的碱基插入,插入片段与non-LTR retrotransposon:MGL的相似度为96.7%,利用此差异可通过PCR技术快速区分谷瘟病菌与稻瘟病菌。谷瘟病菌PWL2基因存在多处单核苷酸变异,通过分析将其划分14个单倍型,分别为P1～P14。单倍型P1占绝对优势包含46个菌株,以此为基础衍生出其他主要单倍型,其次为单倍型P12包含7个菌株,并且多地区都存在特异性单倍型,说明我国谷瘟病菌种群具有较高的遗传多样性。谷瘟病菌中不存在PWL1无毒基因,PWL2无毒基因仅存在部分菌株中,PWL3和PWL4无毒基因存在所有谷瘟菌株中,PWL3和PWL4无毒基因对应的抗病基因在谷子上有重要的应用价值。     

橡胶树胶孢炭疽病菌Cg4LysM基因对菌丝生长的影响

本研究通过PT-PCR技术克隆了橡胶树胶孢炭疽病菌的1个候选效应蛋白基因并命名为Cg4LysM。该基因含1 983 bp的完整开放阅读框(ORF),编码660个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果表明,该蛋白含有4个LysM保守结构域,不含任何跨膜结构域,其1~20位氨基酸是典型的信号肽序列,推测为胞外分泌蛋白。氨基酸序列比对结果表明,Cg4LysM与草莓胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5)、高粱炭疽病菌(Colletotrichum sublineola)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum CBS)的LysM蛋白同源,同源性分别为97%、59%、55%。此外,本研究根据同源重组的原理构建了该基因的敲除突变体△Cg4LysM,进一步分析发现,△Cg4LysM的生长速度慢于野生型菌株,暗示Cg4LysM与胶孢炭疽菌的生长有关。     

油茶(Camellia oleifera)果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)Hog1基因功能和致病性分析

为了探讨Hog1基因在油茶果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)致病过程中的作用。本研究以酿酒酵母中的Hog1基因为依托,进行BlAsTP比对分析油茶果生刺盘孢菌的全基因组数据,以获取与其高度同源的Hog1蛋白序列,通过对ATMT体系进行改进和调整,建立了炭疽病菌基因敲除体系。采用形态观察、显微鉴定、生物学表型分析方法,基于科赫法则(Koch postulates),检测病原菌的致病力大小。结果表明,本试验成功敲除了C. fructicola野生型菌株CFLH16 Hog1基因,发现突变体菌株ΔC.f Hog1与CFLH16相比,其产孢量显著下降,且无法形成附着胞,基本丧失致病能力;ΔC.f Hog1对盐胁迫(NaCl)与CFLH16相比其敏感性显著降低,对细胞壁胁迫(SDS)和过氧化物胁迫(H_2O_2)与CFLH16相比其敏感性不明显。研究发现C.f Hog1基因编码的蛋白质是果生刺盘孢菌生长发育过程中一个重要蛋白,参与调控病菌的附着胞形成、致病过程以及对外界胁迫的应答。本试验针对油茶炭疽病害的功能基因进行探索,为油茶病害分子机制研究提供了参考依据,为进一步实现油茶病害有效调控的目标打下了基础。