猪流行性腹泻病毒纳米抗体融合蛋白真核表达及鉴定

为防控猪流行性腹泻病毒(PEDV)病的流行,构建了靶向PEDV NB3-NB6-Fc纳米抗体融合蛋白的真核表达载体,并探究能否在毕赤酵母中分泌表达.通过实验室保存的pUC57-NB3-NB6-Fc质粒,成功构建分泌表达载体pPIC9 K-NB3-NB6-Fc,经SacⅠ酶将其线性化并电转化入毕赤酵母GS115菌株.经过...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(SID)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗SID区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C3。6株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶51200、1∶6400、1∶12800、1∶6400、1∶51200和1∶25600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为Κ链。Western blot试验结果显示,6株单克隆抗体均能特异性地识别天然PEDV中的S蛋白。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析

以猪流行性腹泻病毒（PEDV）可溶性的猪氨基肽酶N受体为靶蛋白对PEDV S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于PEDV S蛋白的第249-529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV多克隆抗体反应。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-...     

猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病,是导致仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来,猪流行性腹泻的流行区域有逐渐扩大的趋势,已成为中国甚至世界最常见的猪腹泻传染病之一。通过对猪流行性腹泻病毒基因组概述、S基因及其编码蛋白的功能特性、基于猪流行性腹泻病毒S基因的诊断技术及其疫苗研究进展等方面进行综述,以期对猪流行性腹泻病毒S基因研究以及猪流行性腹泻的预防和控制提供帮助。     

猪流行性腹泻病毒S基因的克隆与鉴定

试验利用软件设计出两条特异性引物,再通过PCR扩增,扩增猪流行性腹泻病毒S基因片段,然后将S基因片段连接到表达载体PMD18-T中,构建了重组质粒,转化大肠杆菌后,提取重组质粒,再经过双酶切鉴定和PCR鉴定,来证实提取的基因片段与预期目标一致.本实验为以后建立猪流行性腹泻快速诊断方法、基因免疫、以及猪流行性腹泻病毒基因的进一步的研究工作奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白表达及反应原性分析

为了获得反应原性较好的猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白,利用原核表达系统对S1基因(60~845 bp)进行扩增并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),以1 mmol/L IPTG诱导表达4 h,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:成功构建了pET-30A-S1质粒,重组蛋白得到了表达且具有良好的反应原性,能够被兔PEDV多抗血清识别。本研究为进一步建立ELISA检测方法和亚单位疫苗的研制奠定了物质基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用RT-PCR扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组N蛋白,其大小约为58 ku。将纯化重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1∶1 600~6 400,腹水ELISA抗体效价达1∶1.024×105以上;4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致。本研究为PEDV感染的诊断和致病机制研究提供了有用工具。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白纳米抗体筛选及反应原性检测

通过噬菌体展示技术筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白特异性纳米抗体,验证纳米抗体反应原性.使用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,分别在第0、21、49及70天采集全血,测得抗体效价后分离全血中淋巴细胞,提取总RNA,反转录后PCR扩增目的片段.目的片段和pCANTAB5E使用限制性内切酶酶切连接后转至TG1感受态细胞...     

猪流行性腹泻病病毒的分离鉴定

猪流行性腹泻病,是造成养猪业经济损失严重的传染病之一。本文是针对某养猪场的病死猪进行临床症状观察、病理剖检,通过病毒的分离培养及RT-PCR鉴定,确诊病死猪病原为猪流行性腹泻病毒应加强对猪流行性腹泻病的诊断及监控。     

猪流行性腹泻病毒SD株的分离与鉴定

利用Vero细胞自安徽合肥腹泻仔猪小肠内容物中分离到一株病毒,经胶体金、PCR方法和攻毒试验,确定为猪流行性腹泻病毒,命名为SD株。SD株在Vero细胞上传代,第8代(F8)开始出现稳定的细胞病变(CPE),F8代的毒价(TCID50)为10-6.25/0.1 m L,F8代细胞培养物接种未吃初乳仔猪,接种仔猪均出现典型腹泻症状,死亡仔猪3头(50%),未死亡猪生长严重发育不良,说明SD株具有较强的致病性。     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

Identification and Molecular Characteristics Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variants

To ascertain a diarrhea case in a pig farm in Shandong province,the pathological changes of dead piglets were observed and nested RT-PCR test was carried out on 7 diarrhea samples for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).Pathological examination revealed that intestine was detected as enlargement,hyperemia and edema.After histological examination,the typical microscopic lesions of intestine were disappearance of epithelial cells,villus shrinkage and shortening.The result of nested RT-PCR showed that all of the 7 samples could amplify a specific target band of PEDV.Molecular characteristics of two field strains showed that they had an amino acid homology of 92.3% to 92.4% with vaccine CV777 and 96.6% to 98.6% with other previous field strains which sequences were downloaded from GenBank.Phylogenetic tree analysis further revealed that all of PEDV strains could be mainly divided into two clusters of G1 and G2. G2 consisted of the field strains of our study and other field strains from USA,China and so on,which had the same sequence characteristics of two insertions and one deletion,while G1 consisted of all vaccines of CV777 and several older field strains from China and Korea.These results indicated that our field strains were the dominant strains in recent epidemic diarrhea occurrence.Moreover,its molecular characteristics might be a characterization of differentiating the field and vaccine strains.     

猪流行性腹泻病毒变异株的鉴定和分子特征分析

为查明山东省某猪场流行性腹泻的病因,本研究对该猪场病死仔猪进行病理学检查,并对采集的7份仔猪腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)的套式RT-PCR检测。病理学检查发现病猪的肠道肿胀、变薄、出血,肠绒毛皱缩、变短、边缘粗糙。套式RT-PCR结果显示,7份样品均为PEDV阳性;对其中两份PEDV阳性病料进行S基因扩增,分析其遗传变异,结果显示这两株PEDV野毒株的S基因与参考疫苗株CV777的同源性为92.3%~92.4%,与其他野毒株的同源性为96.6%~98.6%。PEDV的遗传进化树结果显示,PEDV分为两个进化分支G1和G2,G1包括CV777等疫苗株及中国和韩国早期的部分毒株,G2则是PEDV变异株为主的分支,包括本试验分离的野毒株及近年来美国、中国等国的野毒株,这些毒株都存在两个插入突变和1个缺失突变。结果表明,变异株已成为PEDV的流行优势毒株,且这些变异位点有可能成为鉴定PEDV变异株的分子特征。     

基于S基因序列分析新型猪流行性腹泻病毒的遗传演化

最近,笔者实验室在青藏高原地区发现两种新亚型藏猪源猪流行性腹泻病毒（PEDV）,为进一步调查新型PEDV是否在四川腹泻猪群中存在或流行,对实验室2018-2019年保存的116份猪腹泻粪便或肠组织样本进行PEDV的检测及其纤突蛋白基因（spike）分子特征研究。结果表明：腹泻样本的PEDV检出率为42.2%（49/116,95% CI=33.1%~51.8%）,并获得了13条完整的S基因序列,全长为4 149~4 170 bp,序列相似性为94.2%~99.9%,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019的S基因与藏猪源新G1亚群PEDV的序列相似性高达97.0%~98.6%。遗传演化研究结果表明13株PEDV S基因划分为G1和G2大群,其中SWUN-H3-CH-SCYA-2019位于藏猪源新G1亚群;SWUN-19-CH-SCZY-2018、SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-1-CH-SCNJ-2019和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019位于G2亚群中一个独立的分支,且与藏猪源新G2亚群毒株有着较近的亲缘关系。为了进一步研究13株PEDV的演化过程,以贝叶斯进化分析软件包（BEAST）进行分歧时间估算,结果表明SWUN-H3-CH-SCYA-2019的分歧时间约为2012.3年,早于藏猪源新G1亚群其余毒株的最早分歧时间（2015.7年）;SWUN-4-CH-SCXC-2018、SWUN-19-CH-SCZY-2018和SWUN-3CH-CH-SCZG-2019的分歧时间约为2014.2年,早于G2亚群的藏猪源毒株2014.7年,所有藏猪源PEDV的分歧时间均晚于四川毒株。本研究在四川地区首次发现了藏猪源PEDV,并且从毒株的分歧时间推断青藏高原的藏猪源PEDV来源于四川,为新型PEDV分子遗传进化的监测提供了依据。     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的 应用生物学软件与单克隆抗体技术相结合的方法鉴定PEDV S2基因B细胞表位肽。方法 利用CLC Sequence viewer 6.8软件及在线数据库IEDB筛选出PEDV S2基因B细胞表位,并人工合成表位肽。将表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联后作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,通过ELISA法筛选出抗体效价较高的小鼠进行1次加强免疫,3 d后取脾脏制备脾细胞悬液进行细胞融合。经HAT选择培养基培养筛选有效杂交瘤细胞,采用ELISA法筛选阳性克隆继续进行扩大培养。将部分阳性杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,并收集腹水。通过ELISA方法分别检测小鼠腹水和单克隆细胞株培养上清液抗体效价,确定最高效价作为后备细胞株。结果 筛选出B细胞表位肽序列为:MQYVYTPTYYML;免疫多肽抗原后融合前血清抗体效价达到1:2 000;BALB/c小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液ELISA检测结果显示抗体效价达到1:4 000。结论 筛选出了PEDV S2基因B细胞表位,为PEDV表位肽疫苗载体构建研究提供参考。     

猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立

为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平,以纯化的PEDV作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法:当血清OD_(450nm)值0.31时,判定阳性;当OD_(450nm)值小于0.26时,判定阴性;当OD_(450nm)值介于两者之间判定可疑。结果表明,试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测

本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。