反刍动物埃立克体微滴数字PCR方法的建立及初步应用

为建立反刍动物埃立克体(E.ruminantium)准确定量的微滴数字PCR方法(ddPCR),本研究以E.ruminantium p CS20基因为靶基因,选取保守区域设计引物和探针,建立了E.ruminantium dd PCR方法。利用本研究建立的dd PCR方法检测E.ruminantium、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、无形体、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体等,结果显示仅E.ruminantium出现特异性扩增,而与其他寄生虫均无交叉反应,特异性强;将p UC57-p CS20重组质粒标准品10倍倍比稀释(1×10-1拷贝/μL～1×105拷贝/μL)后,利用该dd PCR方法检测,结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.8拷贝/μL,比相应荧光定量PCR方法的敏感性高10倍,本实验建立的dd PCR方法敏感性高;批内和批间重复性试验结果变异系数(CV)均小于2%,重复性好。利用建立的dd PCR方法对50只钝眼蜱样品检测,结果显示,阳性样品反刍动物埃立克体核酸的最低拷贝数为26拷贝/μL,dd PCR和荧光定量PCR检测试剂盒的检出率均为1...     

蜱传反刍动物艾立希体巢式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、敏感检测反刍动物艾立希体的方法,本研究根据GenBank中登录的反刍动物艾立希体pCS20基因保守区设计2对特异性引物,经各反应条件的优化,建立了反刍动物艾立希体巢式PCR检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测反刍动物艾立希体DNA,而对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫和弓形虫的检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法灵敏度可达1.04×101拷贝/μL,是反刍动物艾立希体实时荧光PCR检测试剂盒的10倍,是常规PCR的1 000倍。对50只血蜱、花蜱和微小牛蜱DNA进行检测,巢式PCR、反刍动物艾立希体实时荧光PCR检测试剂盒和常规PCR的阳性检出率分别为26.0%,14.0%和0.0%。本试验建立的巢式PCR检测方法适用于反刍动物艾立希体病的早期诊断和分子流行病学调查,为蜱传反刍动物艾立希体病的防控提供技术支持。     

应用PCR检测犬埃立克体病的研究

用已确证为扁平埃立克体（Ehrlichia platys)和犬埃立克体（E.canis）混合感染的犬全血对6只格犬进行人工感染，通过对其临床症状，血流学变化，血涂片包涵体观察，并将其PCR结果与后来确诊为犬埃立克体病的18只病犬血的PCR结果比较，表明PCR方法能够对早期犬埃立克体病做出准确诊断。     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒(CSFV) 5′端非编码区(UTR)的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为 109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为19.73、22.95和26.24;变异系数分别为0.61%、1.77%和1.18%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.     

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

口蹄疫病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义.     

荧光定量PCR技术检测PRRS变异病毒的研究

为了能准确、快速的检测nsp2基因缺失的猪繁殖与呼吸系统综合征变异病毒(PRRSV),在nsp2基因核苷酸序列上设计了一条上游引物(nsp2-1)和两条下游引物(nsp2-2,nsp2-3),其中一条下游引物(nsp2-2)设计在缺失碱基序列区域。通过条件优化建立了区分经典株和高致病性nsp2基因缺失株的PCR方法;并将最优化条件运用于SYBR Green荧光定量PCR实验,建立了根据融解曲线鉴别nsp2缺失变异株的荧光定量PCR方法,可检出3～6个基因拷贝。     

基于牛呼吸道合胞体病毒F基因TB Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立

为了对牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)进行准确定量检测,针对BRSV F基因设计特异性引物,构建pMD19T-BRSV-gF重组质粒,以其为模板优化反应条件及反应体系,建立TB GreenⅡ荧光定量PCR方法并应用于临床BRSV检测。结果显示,针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好,相关系数为0.995 2;灵敏度高,BRSV最低检测限达3.9×10¹ copies/μL;特异性良好,可特异性检测出BRSV,对牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的扩增呈阴性;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测,荧光定量PCR对BRSV的阳性检出率(26%)明显优于常规PCR方法(14%)。结果表明针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法适合BRSV的临床检测。     

蜜蜂球囊菌荧光PCR快速检测方法的建立及应用

以蜜蜂球囊菌ITS1、ITS2和5.8 S rDNA保守序列(U68313)为参考,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,建立了一种快速检测蜜蜂球囊菌的荧光PCR方法。该方法灵敏度达1 ng/μL的阳性DNA比常规PCR高10倍。检测的特异性高,与蜜蜂幼虫芽胞杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应,同时可避免常规PCR因电泳造成的污染。应用该方法对蜜蜂及蜂制品的实际样品和模拟样品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法在4 h内即可报告结果,与传统病原菌分离培养、常规PCR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可以用于蜜蜂及其制品中蜜蜂球囊菌的快速检测和进出境检疫。     

猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的猪博卡病毒(PBoV)序列,通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PPV、PRRSV及PCV均无交叉反应,具有较高特异性,在107 copies/mL～101 copies/mL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.997,最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。     

荧光定量PCR检测2型猪圆环病毒方法的建立

通过克隆2型猪圆环病毒（PCV2）的开放阅读框2（0RF2）基因编码其核衣壳蛋白（Cap）的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的靶序列设计一对引物和一条TaqMan探针.对PCR反应条件优化后,对构建的标准阳性模板定量,然后1 0＆#215;倍比稀释进行荧光定量PCR（qPCR）扩增并制作标准曲线,初步建立了PCV2检测的qPCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0＆#215;102拷贝/μ L,线性范围为101 ～ 109,达9个数量级,并且具有很好的特异性.对起始浓度为1.0＆#215;108、1.0＆#215; 106、1.0＆#215;104拷贝/μL的标准品的最终实际测得CT均值分别为12.77、19.72和26.89;变异系数分别为0.25％、0.10％和0.13％,均小于1％,说明此方法具有良好的准确性和重复性.     

羊梅迪-维斯那病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

.基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

鸭痘病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,本试验克隆了鸭痘病毒P4b基因,构建重组质粒pMD-DPV-P4b,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的禽痘病毒P4b基因设计合成1对特异性引物及与该引物相匹配的特异探针。以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-DPV-P4b为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了一种检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法与禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒等其他水禽病毒,以及山羊痘病毒和鸡痘病毒等其他痘病毒均无交叉反应,特异性好。该方法最低检测限为1.29×10²拷贝/μL,比普通PCR检测方法高100倍。组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本试验所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适用于鸭痘病毒的检测。     

Establishment of TaqMan Real-time PCR Method for Detection of Duck Poxvirus

To establishment a TaqMan Real-time PCR method for detection of duck poxvirus (DPV),we cloned the P4b gene of DPV.The specific primers and probe were designed according to the nucleotide sequence of avipoxvirus available in GenBank.Recombinant plasmid pMD-DPV-P4b was employed as positive standard template for Real-time PCR.By optimization of reaction conditions,a TaqMan Real-time PCR method for detection of DPV was established.The results of specificity test proved this method had no cross-react with other waterfowl vial agents and poxviruses including avian influenza virus,duck flavivirus,duck hepatitis virus,Newcastle disease virus,duck entertitis virus,goose parvovirus,goatpox virus and fowlpox virus.The detection limit of the assay was 1.29×10² copies/μL of viral DNA,which was 100 times higher than that of the routine PCR.Reproducibility test showed that the CVs of intra assay and inter assay were both less than 2%.Above results supported that the assay was suitable for the detection of DPV very well.     

鸭甲肝病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,N-DRV)、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒(Duck-origin avian paramyxovirus type 1,APMV-1)和禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)均无交叉扩增;重复性佳,组内和组间变异系数最高分别为1.68%和2.19%。对2018年福建地区临床收集的128份鸭源病料进行检测,结果未检测DHAV-2感染阳性。研究结果为DHAV-2的快速检测试剂盒研究及储备DHAV-2检测技术奠定了基础。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

羊鞭虫病实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测羊鞭虫病实时荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的羊鞭虫(Trichuris ovis)ITS基因序列(登录号:JF680987.1),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,建立检测羊鞭虫病的TaqMan实时荧光PCR方法。对反应体系的特异性、敏感性和稳定性进行评价,并用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R^2=0.994,扩增效率E=1.05。该方法特异性强,与其他8种常见家畜寄生性线虫病不发生交叉反应;灵敏度高,最低检出下限为31.7拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数分别为0.43%~1.04%和1.20%~1.91%,均小于2.00%。用建立的实时荧光PCR方法和显微镜检查方法分别对20份临床样品进行检测,实时荧光PCR和显微镜检查方法检出的阳性样品分别为14和9份。本研究建立的TaqMan实时荧光PCR方法能在粪便中快速、准确、灵敏检测羊鞭虫卵,为羊鞭虫病的检测和防控提供新的方法。