捕获ELISA检测人巨细胞病毒IgM抗体

人巨细胞病毒 (ＨＣＭＶ)属疱疹病毒科 ,其感染极为普遍 ,在免疫抑制患者及孕妇中常可导致严重后果。本实验采用重组ＨＣＭＶ (ｒｈＣＭＶ) ｇｐ5 2蛋白[1] 作抗原和辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)标记的鼠抗 ｇｐ5 2单克隆抗体[2 ] ,建立了捕获ＥＬＩＳＡ ,检测血清中的ＨＣＭＶＩｇＭ抗体。现将结果报告如下。1　材料与方法1 1　抗原浓度的确定　ｒｈＣＭＶ ｇｐ5 2蛋白[1] 纯度达 95 %。在捕获ＥＬＩＳＡ检测程序中加入不同浓度的ｇｐ5 2抗原 ,每个浓度重复 3孔 ,将同一抗原浓度的 3个阳性血清Ａ值分别除以 3份阴性血清的平均Ａ值 ,求得Ｐ/Ｎ值…     

巨细胞病毒pp150和gp52融合基因的克隆表达及重组蛋白的抗原性研究

人巨细胞病毒（HCMV）是一广泛传播的人类致病原.我们采用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增了gp52蛋白包含IgM抗原决定簇的基因片段和 pp150蛋白C端包含IgM抗原决定簇的基因片段,然后将 gp52和pp150 两个基因片段串联克隆至pGEX-5x-3表达载体,成功构建了高效表达融合基因的重组载体,并对表达产物的抗原性进行了鉴定.     

胶体金免疫斑点法检测人巨细胞病毒pp150抗体

目的：建立一种简便、快速的检测血清中人巨细胞病毒（HCMV）抗pp150抗体的胶体金免疫斑点法。方法：采用Frens法制备胶体金颗粒，标记葡萄球菌A蛋白（SPA），将本所利用基因工程技术生产的pp150抗原固定于0．45μm孔径的硝酸纤维素膜上，制成免疫斑点检测装置。血清中抗pp150 IgG与硝酸纤维素膜上的抗原结合，然后滴加胶体金标记的SPA，在膜上可形成肉眼可见的红色斑点。结果：胶体金免疫斑点法与ELISA试剂盒对比检测了200份临床确诊血清标本中抗pp150 IgG抗体，胶体金法的特异性和敏感性分别为92％和90％。结论：胶体金免疫斑点法检测血清中的抗pp150抗体特异性、灵敏度较高，简便快速，不需要昂贵的仪器。     

人巨细胞病毒gp52蛋白与pp65蛋白融合表达及初步应用

为提高HCMVIgM抗体检测试剂盒的敏感性及特异眭．本研究重组表达了HCMV糖蛋白gp52与磷蛋白DD65的嵌台抗原。从病毒及质粒中分别扩增gp52(氨基酸181～333,f1)及pp65(氨基酸261～373,f2)两个片段．以不同酶切位点插人到pTrcHi B载体上,筛选正确的重组质粒并在太肠杆菌中诱导表达融合蛋白rp52～65。SDE-PAGE结果显示表达蛋白占菌体总蛋白的30％,卧包涵体的形式存在,分子量为35000。以金属鳌合亲和屡析(IMAC)及分子筛方法纯化表达蛋白,纯度达到96％,回收率为252％。以间接法检测HCMV IgM阳性血清,敏感性达到904％(19／21),证明此融合蛋白具有良好的抗原性,可作为HCMV IgM抗体检测试剂盒的包被抗原。     

巨细胞病毒gp27蛋白表达及其ELISA方法的建立

目的构建高表达巨细胞病毒（CMV）gp27蛋白的重组质粒及工程菌,获取纯化的gp27蛋白抗原。方法采用PCR技术,克隆表达CMV gp27重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法,鉴定其抗原性。结果表达纯化的gp27蛋白纯度〉95%,经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测50份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和30份阴性血清,捕获ELISA法阳性检出率98.0%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;其中1份CMV-IgM阳性血清1∶32稀释后仍能与抗原反应,表明gp27蛋白抗原表位有较好的抗原特异性。结论高效表达纯化的gp27蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测巨细胞病毒抗体。     

三株抗人巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体的鉴定和应用

目的 制备抗HCMVpp65蛋白的单克隆抗体(简称单抗),并对其进行相关研究.方法 以重组表达的HCMVpp65蛋白为抗原,运用杂交瘤技术制备单抗,对获得的单抗进行Ig亚型、特异性、效价和亲和常数的鉴定与测定,并以免疫荧光检测法与进口同类产品进行比较.结果 获得3株针对HCMVpp65蛋白的单抗,即B6、G12、2B12;Ig亚型依次为IgG1κ型、IgG1κ型、IgMκ型;亲和常数依次为3.6×107 L/mol、3.8×107 L/mol、3.1×108 L/mol;免疫印迹试验结果表明,3株单抗都与HCMVpp65蛋白特异性的结合,除2B12外,B6、G12与EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ、HSVⅡ均无交叉反应;与进口单抗平行检测140份临床标本,结果一致(r=1.00,P＞0.05).结论 成功获得3株稳定分泌抗HCMVpp65蛋白的杂交瘤细胞株,所产生的抗体特异性和亲和力较理想,为HCMVpp65蛋白抗原血症检测国产化试剂盒的研制奠定了基础.     

人巨细胞病毒pp65抗体检测方法的建立

目的 建立检测人巨细胞病毒pp65IgG抗体(HCMV pp65 IgG)的间接酶联免疫吸附试验(ELISA).方法 通过棋盘滴定法选择包被抗原和酶标二抗的最适浓度;以商品抗HCMV pp65单抗为阳性模拟标本,建立检测抗HCMV pp65 IgG抗体,并对临床收集的各类血清标本进行检测和分析.结果 检测间接ELISAHCMV pp65 IgG的最佳包被抗原浓度为10 ng/孔,酶标二抗的工作浓度为1∶3000.当阳性吸光度(A)值为0.298时,87份不同组的血清标本(HCMV感染活动组、HCMV感染不活动组、HCMV未感染组)阳性检出率分别为51.6%(16/31)、12.1%(4/33)和0.0%(0/23).3组两两间差异均存在显著性(P＜0.01).结论 本研究建立了检测HCMV pp65抗体的方法,应用该方法能从相应人群中检出该抗体,检测不存在假阳性,并发现该抗体与抗HCMVIgM的检出有关.     

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的建立人巨细胞病毒抗原pp65(HCMVpp65)血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法,以利于临床推广应用.方法以HCMV-AD169感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)爬片作阳性对照,选择试剂和材料组建试剂盒,并与商品化的同类试剂盒作比较,建立人外周血多形核白细胞(PMNLs)中HCMVpp65抗原阳性细胞的检测方法,然后再用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法做相应考评.结果我们建立的HCMVpp65抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的pp65阳性细胞.其可检测限分别为102 pfu/ml的AD169攻击24 h后的HELF细胞爬片和3～5个pp65阳性细胞/2×105 PMNLs;用高相对分子质量(500 000)的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs;用4%中性多聚甲醛固定的细胞片,于-20 °C或以下可长期保存(≥6个月),而且pp65抗原性稳定.结论自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比,检测pp65的结果差异无显著性,并与FQ-PCR的检测结果相一致,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉,适宜临床实验室推广应用.     

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的　建立人巨细胞病毒抗原 pp6 5 (HCMVpp6 5 )血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法 ,以利于临床推广应用。方法　以HCMV AD16 9感染的人胚肺成纤维细胞 (HELF)爬片作阳性对照 ,选择试剂和材料组建试剂盒 ,并与商品化的同类试剂盒作比较 ,建立人外周血多形核白细胞 (PMNLs)中HCMVpp6 5抗原阳性细胞的检测方法 ,然后再用荧光定量PCR(FQ PCR)方法做相应考评。 结果　我们建立的HCMVpp6 5抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的 pp6 5阳性细胞。其可检测限分别为 10 2 pfu/ml的AD16 9攻击 2 4h后的HELF细胞爬片和 3～ 5个 pp6 5阳性细胞 / 2× 10 5PMNLs ;用高相对分子质量 (5 0 0 0 0 0 )的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs ;用 4 %中性多聚甲醛固定的细胞片 ,于 - 2 0°C或以下可长期保存 (≥ 6个月 ) ,而且 pp6 5抗原性稳定。 结论　自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比 ,检测 pp6 5的结果差异无显著性 ,并与FQ PCR的检测结果相一致 ,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉 ,适宜临床实验室推广应用。     

人巨细胞病毒低基质蛋白pp65亲水性片段的克隆与表达

目的 为建立人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染检测方法，表达HCMV早期复制的标志物pp65蛋白，以制备相应的抗体。方法 将pp65全基因和其亲水性强、有抗原代表性的片段（pp65 hp）分别克隆到表达载体pET22b（＋）中诱导表达，并以免疫印迹考察重组蛋白的抗原性。结果 重组rpp65全蛋白表达量低于全菌体蛋白的5％，而rp65 hp蛋白获得高效表达，约为全菌体蛋白的40％，并与HCMV IgG抗体特异性结合。结论 亲水性pp65 hp片段有较好的抗原性，可以制备相应的抗体，来检测HCMV活动性感染。     

风疹病毒E1蛋白原核可溶性表达、纯化及血清学诊断研究

目的 通过基因工程的方法获得风疹病毒E1蛋白在原核系统内可溶性表达,亲和纯化后,评价该重组蛋白在风疹病毒患者血清学诊断方面的可行性.方法 将PCR扩增得到的风疹病毒E1核酸序列克隆至原核表达载体pET-NusA中,利用原核系统表达融合蛋白NusA-E1,用Western Blot和ELISA方法对其抗原性进行初步评价.结果 NusA-E1蛋白以可溶性形式进行表达,亲和纯化后可以获得高纯度的重组蛋白.Western Blot和ELISA方法结果均证明该重组蛋白具有较强的抗原活性.结论 融合蛋白NusA-E1在大肠埃希菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白NusA-E1抗原性强,临床上可以作为血清学诊断抗原,检测风疹病毒抗体.     

Bcl—xL的基因克隆及其原核表达体系构建

目的克隆人Bcl—xL基因全长编码区,并利用载体pet28a在大肠埃希菌（ROS）原核表达人Bcl—xL蛋白,为探讨Bcl—xI。与肿瘤的关系奠定基础。方法分离胃癌患者外周血单核细胞并提取总RNA;采用RT—PCR方法扩增BclxL基因,构建重组表达质粒pet28a／Bcl—xL;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌ROS,测序鉴定后增菌培养,IPTG25C诱导6h,SDS—PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白,进一步利用免疫印迹法鉴定。结果成功扩增获得Bcl—xL基因CDS区全长702bp,与GenBank中发表的序列完全一致;成功构建了原核表达载体pet28a／BclxL,并在工程菌ROs中获得大量表达。结论扩增获得人Bcl—xL基因,并成功原核表达获得人Bcl—xL融合蛋白,为进一步深入研究其生物学功能奠定了基础。     

高水平血清HCMV IgM在低龄儿童原发性HCMV感染诊断中的作用

目的：探讨血清人巨细胞病毒（HCMV）IgM水平在低龄儿童中诊断原发性HCMV感染的意义。方法收集临床诊断为HCMV感染的患儿血标本56例,年龄为0.5-1岁,采用全自动化学发光法分别定量检测血清HCMV IgG、IgM抗体水平,以及IgG亲和力指数。结果 HCMV IgG＋患儿亲和力检测结果发现,其中IgM-/IgG＋的5例患者都为高亲和力IgG,而IgM＋/IgG＋的42例患者中25例是低亲和力IgG,占59.5%。根据IgM定量检测结果进一步将此47例HCMV IgG＋患儿由低至高分成5组,分别为IgM阴性组（〈30 AU/mL）,30-100 AU/mL组,100-170 AU/mL组,170-240 AU/mL组以及大于240 AU/mL组。随着IgM抗体水平的增加,低亲和力样本所占比例呈增高趋势,经卡方检验,差异有统计学意义（χ2=12.72,P〈0.05）。结论在0.5-1岁婴儿中,HCMV IgM水平与HCMV原发感染呈正相关,临床同时参考IgM定量检测和HCMV IgG亲合力检测结果,将对0.5-1岁以内婴幼儿近期HCMV感染发生时间的判定起到有益的互补作用。先进行HCMV IgM定量检测,再进行阳性病例的IgG亲和力检测是低龄儿童原发HCMV感染实验室诊断的可行方案。     

RFP-AWP1原核表达载体的构建及表达特性研究

目的:建立红RFP-AWP1融合基因的原核表达载体,研究其表达蛋白特性。方法:将克隆的人AWP1(associated with protein kinase Crelated kinase 1,AWP1)和水母的红色荧光蛋白(redfluorescence protein,RFP)的cD-NA插入到原核表达载体pET-17b的多克隆位点(mutiple clone sites,MCS)中,经AWP1 cDNA的PCR鉴定和E.coli DE3中的表达鉴定后,E.coli DE3表达AWP1-RFP融合蛋白,荧光显微镜观察其表达特性及与GST-beads的pull-down实验。结果:成功构建了载体pET-AWP1-DsRed1,在大肠杆菌中获得了高效表达的AWP1-RFP融合蛋白,其活菌液在荧光显微镜下呈火山熔岩状的亮红色,干固的细菌呈斑片状红色荧光;AWP1-RFP融合蛋白可与GST-beads结合,并在激发波长为508nm的条件下呈红色荧光,而在波长为488 nm激发光条件下可见橙黄色荧光。结论:在体外验证了AWP1-RFP融合蛋白具有可视性表达的特点,同时发现其能与GST-beads结合,为pull-...     

人脑心肌炎病毒免疫球蛋白M捕获酶联免疫吸附试验的建立及初步应用

目的建立脑心肌炎病毒(EMCV)免疫球蛋白M(IgM)捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,用于感染EMCV血清学早期诊断。方法用抗人IgM(μ链)单抗进行包被,辣根过氧化物酶(HRP)标记的EMCV为酶标抗原,初步建立EMCV IgM捕获ELISA;对建立的方法进行条件优化及特异性、精密性、稳定性等验证。结果建立的EMCV IgM捕获ELISA检测方法抗体包被浓度为1μg/mL,EMCV-HRP工作浓度和反应时间分别为1∶400和45min,封闭液为10%马血清时该法检测效果可达最佳,3批试剂批内及批间变异系数均小于5%,且特异性、精密性及稳定性较好。结论建立的EMCV IgM捕获ELISA法特异、精密且稳定,可用于人感染EMCV的早期检查,为EMCV的诊断奠定基础。     

自噬相关基因Beclin-1的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆并构建自噬相关基因Beclin-1原核表达载体.方法 根据Beclin-1编码区DNA序列设计引物,用前列腺癌细胞LNCaP作为模板进行RT-PCR,扩增Beclin-1编码区全基因片段,与pQE-80质粒连接后进行测序鉴定.结果 RT-PCR扩增出Beclin-1目的基因,限制性内切酶证实其已插入表达质粒中,DNA测序证实Beclin-1编码区全基因片段与GenBank公布的相应基因核苷酸序列的同源性为完全一致.结论 成功克隆并构建了自噬相关基因Beclin-1原核表达载体,为研究Beclin-1蛋白的细胞自噬作用奠定了基础.     

结核分枝杆菌Ag85B蛋白的原核表达、纯化及其促PBMC增殖活性的测定

【目的】在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B蛋白，并对其进行纯化和测定其促人PBMC增殖活性。【方法】将构建的pGEX-Ag85B／BL21活化后接种于LB培养基中，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，包涵体变性后经梯度浓度尿素复性，GST-Sephamse亲和层析、凝血酶切除GST并再次亲和层析纯化；MTT法测定重组Ag85B对人PBMC增殖的促进作用。【结果】成功在大肠杆菌中高效表达出GST／Ag85B融合蛋白，占菌体总蛋白的30％，主要以包涵体形式表达；包涵体复性后经GST-Sephamse亲和层析、凝血酶切除GST并再次亲和层析纯化获得纯度为96％的重组Ag85B蛋白；该蛋白能够促进人PBMC的增殖，增殖幅度随浓度增加而增加，刺激72h时达增殖最高峰。【结论】高效表达并纯化了结核分枝杆菌Ag85B蛋白，该蛋白具有促进人PBMC增殖的活性，为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。     

人Jagged-1蛋白在真核细胞中的表达及稳定株的建立

Jagged-1蛋白属于Notch信号通路的配体之一,而Notch信号通路是介导细胞和细胞之间接触的主要信号通路之一,在造血微环境中调节造血细胞增殖与分化的过程中起重要作用。为研究Notch信号通路中受体与配体结合后的生物学功能及Notch信号通路在骨髓基质细胞影响细胞耐药的作用机制,构建过表达Jagged-1蛋白的NIH-3T3细胞株。构建含Jagged-1全编码区基因的pEGFP-IRES2-Jagged-1真核表达载体。结果表明,重组质粒转染哺乳动物细胞NIH-3T3后,Western blot分析证实转染后NIH-3T3细胞高效表达Jagged-1蛋白;经过选择性培养基筛选及有限稀释法挑取单克隆细胞后,流式细胞术(FCM)分析证实建立起过表达Jagged-1蛋白的单克隆细胞模型,即NIH-3T3-pEGFP-IRES2-Jagged-1细胞株。结论:本研究成功构建了Jagged-1真核表达载体,并建立了稳定转染的单克隆细胞株。过表达Jagged-1蛋白的NIH-3T3单克隆细胞株的构建为我们研究骨髓基质细胞相关的细胞耐药的作用机制并为发现新的药物作用靶点提供条件。     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。