CHO细胞表达人源μ型阿片受体及其活性分析

μ型阿片受体在阿片类药物镇痛与成瘾中发挥重要作用 .从人脑组织总RNA通过一次反转录和两次PCR法扩增获得 μ型阿片受体的cDNA ,将其克隆至pcDNA3 1 (+)中 ,转染CHO细胞后 ,筛选单克隆细胞株并制备膜受体 ,检测重组细胞株表达的 μ型阿片受体与特异性配体的结合能力 .通过饱和性结合和竞争性结合试验证实 ,重组细胞株表达的 μ型阿片受体与天然的 μ型阿片受体具有基本一致的生物学特性 ,为进一步研究阿片受体与配体相互作用的分子机制打下了基础     

人源μ型阿片受体与激动剂慢性作用介导的cAMP上调作用研究

μ型阿片受体是阿片类药物镇痛与成瘾的分子基础。从人脑组织总RNA通过RT-PCR法扩增获得μ型阿片受体的cDNA,将其克隆至pcDNA3．1( )中,转染CHO细胞后筛选单克隆细胞株,检测重组细胞株表达的μ型阿片受体与激动剂慢性作用介导的胞内信号转导能力。通过激动剂慢性作用信号转导分析证实,DAMGO能够明显抑制吗啡慢性给药引起的重组细胞株胞内cAMP水平的上调作用,初步揭示了阿片受体与特异性配体相互作用的信号转导机制。     

大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP质粒构建及其在HEK293细胞中的表达

提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫组化荧光可以观察到μ基因的高强度表达.     

μ阿片受体基因敲出(Knockout)小鼠模型的建立和阿片受体镇痛及成瘾机理的阐明

1992年克隆出阿片δ受体后,已从不同种属的动物克隆出了阿片受体的三个亚型μ、δ和k受体。最近法国Kieffer实验室的Matthes等利用小鼠胚胎干细胞基因敲出技术繁育成功了一个μ阿片受体缺陷的种系小鼠。这种小鼠除无出阿片受体外,生长、发育、生殖和活动周期等与正常小鼠无异,且小鼠的δ和k受体的数量和分布、内源性阿片肽的表达和对热刺激的敏感性都与正常小鼠无异。给予该小鼠吗啡,无镇痛、位置偏爱和身体依赖性作用,给予纳洛酮也不出现撤药综合征。给予δ受体的选择性激动剂也无镇痛作用。说明吗啡的镇痛、位置偏爱和身体依赖性作用由μ受体介导,而与δ和k受体无关。     

在昆虫细胞中表达的人阿片受体与内源性G蛋白功能偶联

通过放射性配体－受体竞争性结合实验,细胞内ｃＡＭＰ水平分析,「＾３５Ｓ」ＧＴＰγＳ结合分析,发现;Ｎａ＾＋和ＧＴＰ能降低激动剂与受体的亲和力;激动剂Ｄ－２－丙氨酸脑啡肽和羟甲芬太尼可以抑制毛喉素刺激引起的细胞内ｃＡＭＰ升高;ＤＡＧＯ和Ｏｈｍ还能有效地刺激「＾３５Ｓ」ＧＴＰγＳ与昆虫细胞膜的结合,而纳洛酮和百日咳毒素的预处理能使激动剂的这种作用降低。     

μ阿片受体基因敲出（Knockout）小鼠模型的建立和阿片受体镇痛及成瘾机理的

１９９２年克隆出阿片δ受体后,已从不同种属的动物克隆出阿片受体的三个亚型μ,δ,和κ受体。最近法国Ｋｉｅｆｆｅｒ实验室的Ｍａｔｔｈｅｓ等利用小鼠胚胎干细胞基因敲出技术繁育成功了一个μ阿片受体缺陷的种系小鼠,这种小鼠除无μ阿片受体外,生长,发育,生殖和活动周期等正常小鼠无异,且小鼠的δ和κ受体的数量和分布,内源性阿片肽的表达和对热刺激的敏感性都与正常小鼠无异。给予该小鼠吗啡,无镇痛,位置偏受和身体依     

醋酸铜诱导家兔排卵前LH峰过程中下丘脑μ—阿片受体密度的变化

下丘脑β-内啡肽（β-EP）活动减弱是排卵前GnRH／LH峰形成的重要因素，为了解下丘脑μ-阿片受体是否参与了这一过程，本文利用放射受体自显影结合计算机图像处理，观察醋酸铜诱导家兔排卵前LH峰过程中下丘脑μ-受体密度变化。给新西兰雌兔注射1％醋酸铜0．9ml（醋酸铜组）或生理盐水（对照组），于注射后不同时间处死，观察下丘脑内侧基底核（MBH）及视前内侧区（MPO）的μ-受体密度变化，结果表明：醋酸铜组给药后1hMPO部位μ-受体密度明显增加（P＜0．05），于给药后3及3．5h明显减少，LH峰出现。MBH部位μ-受体密度变化和MPO部位相似，对照组μ-受体及LH水平无明显波动。相关分析表明：MBHμ-受体密度变化和血LH水平呈显著负相关（γ＝-0．5481，P＜0．01）。上述结果表明下丘脑μ-受体减少与排卵前LH峰形成密切相关。     

人乳铁蛋白cDNA的克隆及序列分析

从北京正常人乳腺组织中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增人乳铁蛋白(hLF)的cDNA,将其克隆到pGEM-T载体上并进行DNA序列测定。结果表明,所克隆的hLF cDNA序列全长为2136bp,其DNA序列与GenBank中另外5个hLF cDNA序列相比,有2个碱基与这5个序列不同：1740位这5个序列是G,本文序列是C;1756位这5个序列是T,本文序列是C。其中1740位碱基的变化导致了第580位氨基酸由Glu变为Asp。     

内皮素A型受体胞内区cDNA的克隆及序列分析

为研究内皮素受体在细胞内的信号传导途径,通过聚合酶链反应(PCR)的方法获得了480bp的内皮素A型受体胞内区cDNA片段,将其克隆进载体pUC19进行核苷酸序列分析,结果表明克隆的cDNA片段与报道的内皮素A型受体cDNA序列只有一个碱基的不同且为同义突变。最后,将克隆的cDNA片段定向克隆进酵母双杂交系统中的引诱蛋白表达载体pGBT9,为探寻与内皮素A型受体相互作用的蛋白质打下了基础。     

蛋氨酸脑啡肽—阿片受体激活免疫细胞抗肿瘤活性的研究进展

蛋氨酸脑啡肽(MENK)是人体中的一种神经递质,其阿片受体广泛存在于免疫细胞表面。MENK与阿片受体相结合,通过调节cAMP-PKA信号通路、Ca2+-钙调蛋白、蛋白激酶C等多种物质的表达,参与到免疫细胞的成熟分化。进一步研究提示,适当剂量的MENK通过激活T细胞、NK细胞、LAK细胞等发挥抗肿瘤的作用。此外,MENK-阿片生长因子受体(OGFr)通路的过表达,直接抑制肿瘤发展与血管生长。     

外周炎性刺激条件下大鼠脊髓背角PPE mRNA及L-ENK样品和μ阿片受体样阳性结构的变化

以鹿角菜胶（ＣＡＲ）注射到大鼠一侧后爪的足底皮下作为伤害性刺激模型,分别于ＣＡＲ刺激后６、１２ｈ和１、３ｄ处死动物,对照组动物仅将盐水注入一侧后爪足底皮下,用原位杂交法和免疫组织化学法观察前原脑啡肽（ＰＰＥ）ｍＲＮＡ阳性神经元、亮氨酸脑啡肽（Ｌ－ＥＮＫ）和μ阿片受体（ＭＯＲ）样阳性结构在大鼠脊髓背角（ＳＤＨ）的分布和变化。对照组大鼠ＳＤＨ内可见到大量ＰＰＥｍＲＮＡ阳性神经元,这些阳性神经元主要分布于Ⅰ、Ⅱ层和Ⅴ、Ⅵ层,ＣＡＲ刺激后６ｈ,刺激侧ＳＤＨ中ＰＰＥｍＲＮＡ阳性神经元的数量明显增多,１２ｈ和１ｄ达到最高水平,３ｄ时略有下降,但仍高于正常水平。Ｌ－ＥＮＫ样阳性纤维和终末主要分布于正常大鼠ＳＤＨ的Ⅰ、Ⅱ层,ＣＡＲ刺激后１ｄ,Ｌ－ＥＮＫ样阳性结构在刺激侧ＳＤＨ中的密度略有升高,３ｄ后下降直至低于正常水平。ＭＯＲ阳性胞体和纤维主要分布于ＳＤＨ的Ⅱ层,ＣＡＲ刺激后１ｄ,刺激侧Ⅱ层中ＭＯＲ阳性结构明显增加,并持续到刺激后３ｄ。上述结果提示阿片类物质在伤害性信息调控中具有重要作用。     

福尔马林致痛提高大鼠中枢μ阿片受体密度及电针的加强作用

用放射自显影方法观察到;（１）大鼠脚掌注射福尔马林后,某些与镇痛有关的脑区如尾核头部、伏隔核、杏仁核、中央灰质、脚间核、中缝大核、脊髓背角等结构中μ阿片受体密度明显增加（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）;（２）给予电针抑制痛反应的大鼠,在其大部分上述结构及扣带回、隔区、视前内侧区、内膝体、上丘、中缝背核及中央上核受体密度明显增加;与福尔马林注射组相比,脚间核、中央灰质尾端腹外侧区、腰膨大背角的受体密度进一步增加。从而在受体水平支持伤害性刺激可以激活体内内阿片肽能活动,而电针可以加强这一活动的设想。     

人外周型苯二氮卓受体及其突变受体cDNA克隆和序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆了三种人外周型苯二氮卓受体ＰＢＲｃＤＮＡ,测序表明,４４２ｂｐ片段与文献报道相比缺失８４ｂｐ编码序列,其转录水平高于正常ＰＢＲ．该序列编码一个与ＰＢＲ结构相关但缺失了２８个氨基酸残基的突变受体蛋白．这一异常转录本可能是通过选择性剪接方式转录产生并只存在于中国人肝癌ＢＥＬ７４０２细胞系,表明ＰＢＲ基因表达具有细胞特异性和异质性．突变受体的发现为研究ＰＢＲ的结构和功能提供了理想的分子和细胞模型     

阿片μ受体阻滞剂对习得性无助小鼠运动能力及抑郁、焦虑样行为的影响

目的 探讨阿片μ受体(μopioid recepters,μRs)阻滞剂对习得性无助小鼠运动能力及行为的影响。方法 将小鼠随机分为学习-消退组、共轭组、对照组。在小鼠学习逃避电击刺激实验前进行μRs阻滞剂β-FNA或生理盐水(Sal)预处理。将小鼠在旷场实验中的运动距离进行t检验以观察小鼠的运动能力,通过穿梭箱、强迫游泳、高架十字迷宫、旷场等实验探究阻滞μRs后小鼠无助行为的变化。结果 两组小鼠较对照组运动距离无显著性差异;两组小鼠在3 d学习期内的被电击时间无差异;两组小鼠第2天与第3天的鼻触器触碰总次数具有显著性差异(P<0.001)。结论 阿片μ受体阻滞剂对习得性无助小鼠的运动能力无影响,μRs在对小鼠的逃避厌恶刺激的行为形成过程中有着重要调节作用。     

人尿激酶受体cDNA的克隆及序列测定

以高转移性人肺巨细胞癌细胞系PG的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人尿激酶受体(uPAR)的cDNA。将其亚克隆至pGEM-T载体后进行测序,结果表明,我们所克隆的uPAR cDNA片段与文献报道的人uPAR基因编码区cDNA序列高度同源(达99%),其中第705、746和755碱基分别由A、A和G替代了文献中的T、G和A,从而导致了第249和252位氨基酸由Gly和Glu变为Asp和Gly,我们已将此序列申请登录GenBank,登录号为AF257789。     

人外周型苯二氮卓受体及其突变受体cDNA克隆和序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆了三种人外周型苯二氮卓受体ＰＢＲｃＤＮＡ,测序表明,４４２ｂｐ片段与献报道相比缺失８４ｂｐ编码序列,其转录水平高于正常ＰＢＲ,该序列编码一个与ＰＢＲ结构相关但缺失了２８个氨基酸残基的突变受体蛋白,这一异常转录本可能是通过选择性剪接方式转录产生并只存在于中国人肝癌ＢＥＬ７４０２细胞系,表明ＰＢＲ基因表达具有细胞特异和异质性,突变受体的发现为研究ＰＢＲ的结构和功能提供了理     

人白介素6cDNA的克隆及在CHO细胞中的表达

人白细胞介素6(IL-6)是一种关键的多功能的细胞因子,它对造血、免疫和急性期应答起重要作用。重组IL-6在辐射损伤,血小板减少、肝损伤、肿瘤及艾滋病的研究与治疗中具有重要意义和潜在的应用前景。本研究通过引物设计、转译优化及DNA体外重组等技术构建了pSV-IL-6重组质粒,在大肠杆菌中大量扩增、纯化后,利用磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr~ ),经选择培养基培养2周后,挑出CHO-dhfr~ 细胞克隆,并用逐渐提     

大鼠脑α1型甲状腺激素受体基因cDNA克隆及序列分析

使用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑α１型甲状腺激素受体的ｃＤＮＡ,得到包含起始及终止密码子共１２３３ｂｐ、编码４０９个氨基酸的受体全长编码离列,酶切分析后,将此特异ＤＮＡ片段重组入质粒ｐＵＣ系统,得重组质料ｐＴＲＡ。双脱氧末端终止法测定了全部核苷酸顺序。     

全长及缺失VLDL受体基因转染的CHO细胞与β-VLDL的结合效应

为探讨 VLDL受体结合域中 8个重复序列在结合 VLDL中所起的作用 ,利用构建的全长VLDL受体 c DNA和缺失 5个重复序列的该受体 c DNA重组表达载体分别导入 CHO细胞中 .RT- PCR可检测到外源性 VLDL受体基因的表达 .受体与配体结合研究表明 ,转染全长 VLDLR重组体的 CHO细胞结合β- VLDL的能力明显高于转染 VLDLR缺失重组体的 CHO细胞 ,表明人VLDL受体在 CHO细胞中能有效表达 ,而缺失 5个重复序列的 VLDL受体基本失去了结合β-VLDL的能力