RNA干扰技术抑制耐药细胞MDR1基因表达的研究

目的： 探讨载体表达的小干扰RNA (siRNA)抑制MDR1基因的表达，并逆转卵巢癌耐药细胞多药耐药的可行性。 方法： 浓度梯度诱导法和人MDR1基因载体转染法建立阿霉素耐药细胞株OVCAR/AR和多药耐药亚株OVCAR/MDR细胞。脂质体介导将MDR1特异性siRNA的表达载体(pSN/mdr1a和pSN/mdr1b)转染耐药细胞，实时定量RT-PCR方法检测MDRl mRNA的表达，流式细胞术检测P-gp的表达，MTT法检测耐药细胞对化疗药的抵抗性。 结果： 耐药细胞OVCAR/MDR细胞MDR1 mRNA的表达高于OVCAR/AR细胞，两者均高于其亲代细胞OVCAR-3；转染pSN/mdr1a和pSN/mdr1b可显著抑制两株耐药细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达，OVCAR/MDR和OVCAR/AR细胞对阿霉素抗药性的逆转率分别为79.5%和93.9%。 结论： 载体表达的MDR1特异性siRNA可抑制卵巢癌耐药细胞亚株MDR1基因的表达，因而增加耐药细胞对化疗药物的敏感性。     

转染肿瘤坏死因子-α及MDR1反义RNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的:转染肿瘤坏死因子-α(TNF-α)cDNA和多药耐药基因(MDR1)的反义RNA到乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,并观察它们在乳腺癌耐药逆转中的作用.方法:应用RT-PCR和DNA重组技术构建反义绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,检测转染前后细胞的生长曲线、细胞凋亡程度、MDR1-mRNA和P糖蛋白(P-gp)表达情况及对ADR敏感性的变化.结果:转染后的细胞生长明显减慢,凋亡率显著增加,MDR1-mRNA和P糖蛋白(P-gp)表达明显降低,对ADR的耐药性明显下降,敏感性增加.结论:联合运用不同的逆转耐药机制,将TNF-αcDNA及MDR1反义RNA分别或同时导入乳腺癌耐药细胞中,能有效达到逆转耐药的目的.     

转染肿瘤坏死因子-α及MDR1反义RNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的：转染肿瘤坏死因子-α(TNF-α)cDNA和多药耐药基因(MDR1)的反义RNA到乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达，并观察它们在乳腺癌耐药逆转中的作用。 方法：应用RT-PCR和DNA重组技术构建反义绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体，分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达，检测转染前后细胞的生长曲线、细胞凋亡程度、MDR1-mRNA和P糖蛋白（P-gp）表达情况及对ADR敏感性的变化。 结果：转染后的细胞生长明显减慢，凋亡率显著增加，MDR1-mRNA和P糖蛋白（P-gp）表达明显降低，对ADR的耐药性明显下降，敏感性增加。 结论：联合运用不同的逆转耐药机制，将TNF-α cDNA及MDR1反义RNA分别或同时导入乳腺癌耐药细胞中，能有效达到逆转耐药的目的。     

芸香苷逆转人大肠癌LoVo/5-氟尿嘧啶细胞耐药性及其机制

目的 探讨芸香苷（RT）对大肠癌耐药株LoVo/5-氟尿嘧啶（5-FU）细胞耐药性的影响及其机制。方法 采用浓度梯度递增法建立耐药株LoVo/5-FU细胞;用不同剂量的RT和（或）5-FU处理48 h后,采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,RT-PCR法检测P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）的mRNA表达水平,Western blotting法检测P-gp、MRP1、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、Akt、Survivin、细胞周期蛋白A（cyclin A）和细胞周期素依赖性蛋白激酶2（CDK2）的蛋白表达水平。结果 LoVo/5-FU细胞中P-gp、MRP1和Survivin蛋白表达水平均显著高于LoVo细胞;5-FU和RT对LoVo/-FU细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为21.77 mg/L和98.43 mg/L;在10 mg/L RT作用下,5-FU对LoVo/5-FU细胞的IC₅₀ 降至10.64 mg/L,逆转倍数为2.05;RT可协同增强5-FU引起的LoVo/5-FU细胞凋亡和S期阻滞,抑制P-gp和MRP1基因表达以及Akt磷酸化,下调Survivin、cyclin A和CDK2蛋白水平。结论 RT可通过抑制Akt信号通路以及耐药相关蛋白的表达反转LoVo/5-FU细胞对5-FU的耐药性。     

沉默miR-21对子宫内膜癌顺铂耐药细胞株Ishikawa/DDP的影响

目的:观察沉默miR-21对子宫内膜癌顺铂耐药细胞株Ishikawa/DDP的影响.方法:以Lipofectamine 2000介导miR-21抑制剂转染Ishikawa/DDP细胞株,同时设置阴性组和耐药组.采用反转录PCR检测miR-21、多药耐药基因MDR1、促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2的表达.采用蛋白印迹法检测多药耐药蛋白P-gp、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.采用噻唑蓝比色法检测细胞对顺铂的敏感性.采用流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:与耐药组和阴性组比较,抑制剂组miR-21,MDR1和Bcl-2 mRNA表达显著下调(P＜0.0l),而Bax mRAN表达显著上调(P＜0.00l);抑制剂组P-gp和Bcl-2蛋白表达显著低下调(p＜0.05),而Bax蛋白表达显著上调(P＜0.001).与耐药组和阴性组比较,顺铂对抑制剂组的IC50值显著(P＜0.001);顺铂对抑制剂组细胞的诱导凋亡率显著增加(P＜0.00l).结论:沉默miR-21可显著提高Ishikawa/DDP细胞株对顺铂的敏感性,并促进细胞凋亡,其具体机制可能与下调MDR1,P-gp和Bcl-2表达,以及上调Bax表达有关.     

干预HSF1影响MDR1的表达逆转结直肠癌HCT-8细胞株耐药的实验分析

目的探讨热休克转录因子1(heat shock factor 1, HSF1)表达水平与MDR1、Cyclin D1、MMP-2、BCL-2的关系,以及对HCT-8/FU细胞株克隆和侵袭能力的影响。方法采用Western blot法检测HCT-8/FU细胞株及结肠腺癌非耐药细胞株HCT-8中HSF1及MDR1的表达。设计2条针对HSF1基因的干扰RNA表达载体及阴性对照载体,分别稳定转染HCT-8/FU细胞。采用RT-PCR及Western blot法检测各组中HSF1、MDR1的mRNA及蛋白表达量,并通过克隆实验及Transwell实验检测各组细胞生长情况和侵袭能力。通过CCK-8实验检测不同药物浓度中各组细胞的增殖活性。结果 HCT-8/FU耐药细胞株中HSF1、MDR1的蛋白表达量均高于HCT-8细胞株,差异有统计学意义(P0.01)。沉默HSF1的细胞中MDR1表达水平下降,而过表达HSF1细胞株中MDR1的表达水平增高,差异有统计学意义(P0.01)。CCK-8细胞增殖实验结果显示沉默HSF1可提高耐药细胞对化疗药物的敏感性,其细胞增殖活性降低(P0.05)。与空白对照组相比,沉默HSF1后Cyclin D1、MMP-2与BCL-2表达降低,可明显抑制肿瘤细胞克隆及体外侵袭能力,过表达HSF1则可增强肿瘤细胞的克隆和体外侵袭能力,差异有统计学意义(P0.01)。结论结直肠癌中HSF1作为转录因子可促进肿瘤细胞的克隆及侵袭,同时其高表达可启动MDR1的转录与翻译,进而促进肿瘤耐药。     

川芎嗪与环孢菌素A联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的逆转作用

目的研究中药川芎嗪(TMP)与环孢菌素A(CsA)联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的耐药性逆转作用及可能机制。方法应用非细胞毒性剂量的TMP和CsA单独及联合作用于K562/S和K562/MDR细胞,MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)的药敏性,计算耐药倍数及逆转倍数。利用罗丹明123(Rh123)进行蓄积与排出试验,免疫组化检测P-gp的表达,RT-PCR方法检测MDR1基因的表达。结果与K562/S细胞相比,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA可显著降低ADM对K562/MDR细胞的IC50(P0.01),逆转倍数分别为4.9倍及9.2倍,两者联合应用,逆转倍数为15.4倍。TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显低于单独应用(P0.01);TMP和CsA单独及联合应用,MDR1基因表达均有不同程度的下调。结论 TMP和CsA联合逆转K562/MDR细胞的多药耐药性具有协同作用,其机制可能与下调MDR1基因表达和降低P-gp水平有关     

转染抗mdr-1核酶基因逆转肿瘤细胞耐药性的研究

目的　研究转染抗mdr 1核酶基因能否实现对乳腺癌细胞多药耐药 (MDR)的持久逆转。方法　构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)为报告基因的核酶表达质粒并转染耐阿霉素的人乳腺癌细胞株MCF 7/ADR和敏感株MCF 7,激光共聚焦显微镜观察EGFP的表达 ,流式细胞术检测细胞转染率和P 糖蛋白含量 ,逆转录 (RT) 聚合酶链反应 (PCR)检测细胞的mdr1mRNA ,罗丹明 12 3(Rh12 3)外排实验检测细胞的P 糖蛋白转运功能。加入阿霉素 4 8h后 ,常规MTT法检测细胞存活率。结果　转染抗mdr 1核酶质粒RZ196和RZ179后 ,两组实验细胞的mdr 1指数由 2 2 0分别降为 0 76和 1 4 0 ,P 糖蛋白表达率由 5 5 0 %降为 4 6 %和 18 2 % ,Rh12 3荧光强度由 2 2 0 %升为 4 6 2 %和 70 1% ,细胞存活率由 75 %降为 2 8%和 4 3%。并且核酶质粒可在细胞内稳定表达 ,转染RZ196、RZ179的实验细胞经G4 18筛选完成 2个月后 ,细胞质中仍可见明显的EGFP表达 ,细胞的mdr 1指数分别为 0 81、4 17,P 糖蛋白表达率分别为 5 2 %、19 5 % ,Rh12 3荧光强度分别为 5 1 4 %、71 6 % ,与刚完成筛选时的差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　转染抗mdr 1核酶质粒RZ196和RZ179均可持久逆转肿瘤细胞MDR ,其中RZ196的逆转效果更好     

靶向MDR1基因的RNAi稳定逆转结肠癌细胞的多药耐药性

目的： 探讨靶向多药耐药蛋白-1 (MDR1)基因的RNA干扰（RNAi）对结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的多药耐药性的稳定逆转作用。方法：分别构建含编码#4029 MDR1 siRNA和#4123 MDR1 siRNA的质粒载体,并转染COLO 320DM结肠癌多药耐药细胞,采用G418筛选克隆细胞,经实时定量RT-PCR及Western blotting鉴定阳性克隆细胞。MTT法检测细胞活力并计算各抗肿瘤药的IC50。流式细胞术检测细胞周期并计算PI/AI值。流式细胞仪测定细胞内adriamycin药物累积浓度。结果：阳性克隆细胞（clone #4029和clone #4123）的MDR1 mRNA和P-gp的表达均被抑制。COLO 320DM结肠癌亲本细胞adriamycin及vincristine的IC50分别为9.616 μmol/L和0.358 μmol/L,而clone #4029的IC50分别降至1.094 μmol/L和0.023 μmol/L（P<0.01）,clone #4123的IC50分别降至0.780 μmol/L和0.035 μmol/L（P<0.01）。COLO 320DM结肠癌亲本细胞用adriamycin及vincristine处理后其PI/AI值分别为5.68及9.59,而clone #4029的PI/AI值分别降至2.74及3.59（P<0.01）,clone #4123的PI/AI值分别降至2.75及3.24（P<0.01）。COLO 320DM结肠癌亲本细胞用10 μmol/L adriamycin处理后细胞内adriamycin累积浓度为27.92,而clone #4029及clone #4123细胞内adriamycin累积浓度分别增加至187.24和215.57（P<0.01）。结论：稳定转染含编码MDR1 siRNA的质粒载体能稳定逆转结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的多药耐药性。     

沉默XIST对结直肠癌细胞阿霉素耐药性的抑制作用及其机制

目的:探讨X染色体失活特异转录物(XIST)在结直肠癌(CRC)细胞对阿霉素(又称多柔比星,DOX)耐药中的作用及其可能的分子机制。方法:通过DOX浓度递增处理CRC细胞LoVo和HCT116,获得DOX耐药细胞LoVo/DOX和HCT116/DOX。采用RT-qPCR检测XIST和微小RNA-124(miR-124)在DOX耐药CRC细胞中的表达;转染XIST小干扰RNA(si-XIST)后,通过Western blot检测LoVo/DOX细胞和HCT116/DOX细胞中P-糖蛋白(P-gp)和谷胱甘肽S-转移酶π(GST-π)的蛋白水平。通过萤光素酶报告基因实验来证明XIST与miR-124的相互作用。转染miR-124、si-XIST或si-XIST+anti-miR-124后,通过Western blot检测LoVo/DOX细胞和HCT116/DOX细胞中P-gp和GST-π的蛋白水平。结果:在DOX耐药CRC细胞中,XIST表达上调(P0.05),miR-124表达下调(P0.05)。XIST沉默显著降低DOX耐药CRC细胞中的P-gp和GST-π蛋白水平(P0.05)。萤光素酶报告基因实验结果显示,XIST存在miR-124结合区域。转染miR-124显著降低DOX耐药CRC细胞中P-gp及GST-π蛋白水平(P0.05);而转染anti-miR-124则可逆转由XIST沉默导致的DOX耐药CRC细胞的P-gp及GST-π的降低(P0.05)。结论:在DOX耐药CRC细胞中,沉默XIST可能通过调节miR-124来抑制DOX的耐药性。