夜光藻配子细胞实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

夜光藻是我国广泛分布的赤潮原因种之一,其有性繁殖在种群增长中的作用尚不明确,定量分析配子细胞是研究夜光藻有性繁殖过程的重要手段。利用实时荧光定量PCR技术,以夜光藻rRNA基因的18S-ITS1为靶区域,建立了定量检测夜光藻配子细胞的方法。以配子细胞基因组DNA和含目的片段的重组质粒分别建立标准工作曲线,二者均呈现良好的线性响应,检出限分别为每反应0.17个细胞和10²个拷贝,满足定量检测应用需求。应用该方法对2015年逐月采集的胶州湾环境样品进行检测,并首次对夜光藻配子细胞的季节变化、水平分布与垂直分布进行了研究。结果表明,调查海域夜光藻配子丰度呈冬末春初、夏季双峰分布,范围为18.12~9.70×10⁵ cells/L;在水深小于10m的湾内近岸站位,配子丰度较低,垂直分布均匀;在湾中心、湾口和湾外的深水站位,配子丰度较高,仅在2~3月、7月和11月出现垂向差异。夜光藻配子细胞对种群增长和存续有潜在的积极意义,其丰度在营养细胞丰度高值期相对较高,在营养细胞丰度极低时仍可普遍检出。丰富了对近岸海域夜光藻配子细胞时空分布的认识,为深入研究夜光藻的种群增长模式、进一步探究其赤潮暴发的内在机理奠定了基础。     

环介导恒温扩增技术快速检测米氏凯伦藻方法的建立环介导恒温扩增技术快速检测米氏凯伦藻方法的建立

利用环介导恒温扩增（LAMP）技术成功检测了米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)基因,并对其反应程序和反应体系进行了优化,建立起一种简单快速的微藻检测技术。利用本实验优化体系对米氏凯伦藻进行了LAMP扩增,得到了理想的扩增产物,同时以其他8种藻类为阴性对照实验,只有米氏凯伦藻为特异性扩增,其他藻类均呈现阴性反应。另外,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与以F3和B3为引物PCR扩增的片段相比较,均与预期结果相吻合。采用2种方法进行阳性反应检测,一是阳性反应管内可见白色焦磷酸镁沉淀,二是LAMP产物与SYBR Green I反应呈现绿色。这种技术简单快速,有望应用到赤潮藻类的现场检测,在赤潮的预测预报中发挥强大作用。     

环介导恒温扩增技术快速检测米氏凯伦藻方法的建立

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi,Hansen)属于裸甲藻目(Gymnodiniales),裸甲藻科(Gymnodi-niaceae),凯伦藻属(Karenia)。它能产生溶血性(hemolytic)毒素和鱼毒(ichthyotoxins),溶解鱼类细胞,破坏鱼鳃组织结构,使鱼类无法正常呼吸而窒息死亡[1]。近年来,米氏凯伦藻引起的赤潮在世界各海域屡次发生,日本海域,墨西哥湾,新西兰、韩国、苏格兰和澳大利亚海域都有米氏凯伦藻引发赤潮的报道,对渔业造成很大损失[2]。     

2012年福建沿海大规模米氏凯伦藻赤潮暴发的水文气象原因探讨

本文利用ERA-Interim资料集、HYCOM全球再分析资料以及沿海各站点数据,通过分析比较2005、2011和2012年福建沿海春季(3—5月)气温、水温、风场、流场和降雨数据,探讨了2012年春季水文、气象要素的年际变化特征及其与米氏凯伦藻暴发的关系。结果表明:2012年春季暴发的大规模米氏凯伦藻赤潮极可能与初春水温偏低,晚春水温偏高,后期海水迅速升温有关:初春(3月)沿海水温偏低,抑制了东海原甲藻的前期孕育;晚春(5月)水温偏高,有利于各种藻类,特别是偏暖暴发的米氏凯伦藻的生长;3—5月海水过快的升温过程,使得米氏凯伦藻成为优势藻种。相对于气候态平均而言,2012年5月呈强北风特性,水体向岸堆积作用明显,有利于藻类在近岸的堆积聚集和种群密度的提高,为藻类的生长提供了稳定的动力环境,促进了赤潮的暴发。此外,2012年1—4月的大降雨量可能为米氏凯伦藻的生长提供了良好的生物化学环境。     

4株米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻际异养细菌的分离鉴定

采用分子生物学方法,对分离的米氏凯伦藻4株藻际异养细菌进行分子鉴定和功能分析。结果表明,经16S rRNA序列分析,4株藻际异养细菌分别隶属于Formosa、Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter四个属,P1菌株与Formosa的16S rRNA核苷酸序列的同源性为95%,P2、P3和P4菌株与Erythrobacter、Shewanella和Marinobacter的同源性在99%以上。通过4株异养细菌及其同源性大的24株细菌构建进化树得出,28株细菌在系统发育树中主要分成4个分支,与同源性分析相符。     

2012年三沙湾米氏凯伦藻赤潮的生态特征及成因分析

为了理清米氏凯伦藻赤潮形成与环境因素的关系,掌握其发生、发展规律,本文分析了2012年春末夏初三沙湾海域米氏凯伦藻赤潮期间的气象、水文和营养盐情况,并结合室内模拟培养实验,探讨了米氏凯伦藻赤潮形成与各环境因素的相关性。结果显示米氏凯伦藻赤潮通常发生在温度为20.5~25.0℃和盐度为24.3~32.3的海域,其细胞生长的最适温度和最适盐度分别为:22.0~25.0℃和26.0~30.0;Pearson相关性分析显示,米氏凯伦藻细胞密度与叶绿素a、无机磷、化学需氧量呈极显著正相关,与透明度、氨氮呈显著负相关;另外,米氏凯伦藻对磷酸盐的需求较低,其赤潮的形成可能主要受水体中氨氮的影响。基于现场调查和模拟实验结果,综合分析认为稳定的水文和气象条件、发生前期降雨输入的无机氮,以及由于持续阴雨导致的较低光照条件是此次米氏凯伦藻赤潮形成和维持的重要条件。     

锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒（KHV）的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列（GenBank AB182940）,利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为：Ct=-3.45 lgX＋42.73（相关系数R2=0.989）。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。     

实时荧光定量PCR分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是定量分析基因表达的常用方法,选择合适的内参基因对准确分析目的基因表达水平至关重要。本研究以不同铁浓度培养条件下的玛氏骨条藻为材料,定量分析Cytb、EF-1α、HPRT、UBC、GAPDH、β-actin以及β-tubulin 7个内参基因的表达情况,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对这些内参基因的稳定性进行综合评价。结果表明,Cytb和EF-1α的表达稳定性较好,EF-1α+Cytb组合的稳定性最佳,是玛氏骨条藻基因表达研究的理想内参基因,而其他基因的表达稳定性较差,不适合作为内参基因。本研究为玛氏骨条藻基因表达研究过程中内参基因的选择提供了方法学上的依据。     

花鲈PPARα基因实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

利用SYBR荧光定量PCR技术,制备用于花鲈（Lateolabrax japonicus）PPARα基因实时荧光定量PCR检测的质粒标准品．通过PCR扩增出目的片断344-bp,纯化后连接至pMDI8-T载体,转化宿主菌E．coli DH5α．通过PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析后抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍梯度稀释成标准品模板10^8～10^4 copy／mm^3,进行荧光定量PCR分析．结果显示,循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系．     

九龙江河口水体叶绿素a含量和初级生产力的时空变化

根据2009年春（5月）、夏（8月）、秋（11月）在九龙江河口水域进行的生态安全示范区综合外业调查资料,研究了九龙江河口水体叶绿素a含量和初级生产力的时空变化．结果表明,九龙江河口水体叶绿素a含量变化范围为0．77～15．89mg／m。,平均含量为3．11mg／m。;初级生产力变化范围为19．05～332．91mr,／（m。·d）,平均值为103．51mg／（m。·d）．叶绿素a含量均值以夏季的为最高（4．01mg／m。）,其季节变化呈夏季〉春季〉秋季;初级生产力均值以春季的为最高[112．16mg／（m。·d）],季节变化呈春季〉夏季〉秋季的趋势．与本研究区上世纪90年代的调查结果比较,本次调查的表层水叶绿素a含量均值（3．11mg／m’）为1990年均值（2．24mg／m。）的1．3—1．6倍,而初级生产力均值[103．5mg／（m。·d）]则比1990年的[151．6mg／（m。·d）]降低了约32％．叶绿素a含量与初级生产力、可溶性硅酸盐含量、水温在这3个季节均显著正相关,与浮游植物密度的分布并不一致,二者的相关性并不显著．在高无机氮和高可溶性硅酸盐含量状态下,水温与活性磷酸盐含量对九龙江河口水体叶绿素a含量和初级生产力的时空变化起调控作用．     

九龙江口磷的界面分配和转移

１９９２年８月航次调查结果表明，九龙江口水体中磷的迁移呈保守行为，ＴＰ和ＰＰ含量随着海水盐度的降低呈增加趋势，ＤＰ含量刚好相反；Ｓ〈１５的低盐区，盐度对磷迁移的影响比较显著。     

九龙江口红树林保护区水体浮游植物群落结构及营养状态评价

于2016年1月(冬季)、4月(春季)、7月(夏季)以及10月(秋季)对九龙江口红树林保护区的浮游植物多样性组成及其时空变化进行研究.结果表明,福建九龙江口红树林保护区共采集到浮游植物5门91属138种,其中硅藻占50.00%、绿藻占31.16%、蓝藻占8.70%、甲藻和裸藻各占5.07%.主要优势种为具槽直链藻(Melosira sulcata)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、条纹小环藻(Cyclotella stratia)、舟形藻(Navicula sp.)、粗针杆藻(Synedra robusta)和菱形藻(Nitzschia sp.);浮游植物细胞数量在0.82×105~4.55×105个/dm3之间,年平均数量为1.97×105个/dm3.浮游植物种类时空变化明显,而数量的空间变化较大,季节变化不太明显.Shanno-Wiener指数、Margalef丰富度指数和Pielou均匀度指数变化范围分别为2.10~3.55、1.05~3.61、0.78~0.95.多样性指数及浮游植物生物量评价结果显示,九龙江口红树林保护区的水体为中营养状态,水质较好,但仍应加强对陆源径流和养殖废水排放进入红树林的控制和管理.     

深圳海域水体和九龙江口沉积物中TCBS茵群与弧菌相关性的研究

通过传统的TCBS培养基平板计数法、16SrDNA—RFLP（16SrRNA基因的限制性酶切图谱多样性分析）及16SrDNA序列分析等方法对深圳海域水体和九龙江口沉积物中弧菌数量分布进行研究．结果表明TCBS菌群数中弧菌所占的比例因不同采样地点、不同季节而呈现较大差异．在深圳西海域及九龙江口上游盐度较低（盐度〈11）的区域,TCBS菌群中弧菌所占的比例为0,TCBS菌群数与弧菌总数不相关;在河口下游盐度相对较高的区域,弧茵占TCBS菌群数的6．0％～92．0％,TCBS菌群数与弧茵总数不相关或相关性不大;高盐度的海水区域弧菌占TCBS菌群数的37．O％～100．0％,TCBS菌群数与弧菌数量显著相关（P〈0．05）．因此环境监测过程中利用TCBS培养基检测海洋弧菌数量时,应该通过分子鉴定或生理生化鉴定方法进行验证,以保证数据的科学性．     

九龙江河口区海水水质模糊综合评价

根据九龙江河口区2011—2018年的监测数据,分析了该海域海水中无机氮(inorganic nitrogen, DIN)、活性磷酸盐(active phosphate, DIP)、化学耗氧量(chemical oxygen demand, COD)和石油类含量的年际变化趋势和平面分布特征,并应用模糊综合评价法对九龙江河口区的水质进行了评价。结果表明,2011—2018年,九龙江河口区DIN和DIP年均含量呈现先增加后降低趋势,COD年均含量呈现逐年下降趋势,而石油类年均含量总体呈波动变化趋势;DIN、DIP、COD和石油类均受九龙江径流输入的影响,含量平面分布大部分呈现西南部高于东北部的特征。模糊综合评价显示九龙江河口区水质为Ⅳ类水,主要污染物是DIN和DIP。水质综合评分值逐年变大,表明水质开始出现好转趋势。     

九龙江口生物可利用磷的行为与入海通量

于1995年3、5月在九龙江口进行两个航次的现场调查,研究不同形态磷的河口行为,并估算生物可利用磷的入海通量。结果表明,在S＜20区域内,溶解活性磷（DRP）的行为受控于“缓冲机制”,其含量在8～10μg／dm3水平上下波动。颗粒磷中MgCl2。可提取磷（MgCl2-P）含量随盐度增大而增大,并与叶绿素a以及悬浮物中Fe、Mn、Al含量呈正相关关系。NaOH／NaCl可提取磷（NaOH／NaCl－P）随盐度增大按指数关系下降,其含量与悬浮物中Fe、Mn、Al含量呈正相关关系。HCl可提取磷（HCl－P）在河口区的行为表现为保守混合。九龙江口生物可利用磷入海通量约517t／a,其中潜在生物可利用磷（PBAP）的贡献为溶解活性磷（DRP）的3倍。     

九龙江口沉积物砷含量的分布特征及与环境因子的相关性

采集九龙江河口表层和柱状沉积物样品,对表层沉积物中总砷、不同形态砷和其他重金属元素、有机质含量以及粒径等参数进行测定.分析了柱状沉积物中总砷和各形态砷的含量,结合沉积速率和响应因子,探讨总砷的污染累计特征.结果表明：（1）沉积物中检出的形态砷是As3＋和As5＋,未检出有机砷.（2）表层沉积物中总砷含量范围为10.03～11.29μg/g,河端总砷含量为11.28μg/g,高于海端总砷含量10.42μg/g.As3＋的含量范围为0.84～1.08μg/g,As5＋的含量范围为6.87～8.99μg/g;As5＋含量表现为河端（8.63μg/g）高于海端（7.31μg/g）,As3＋则不明显.（3）有机质含量是影响本区域表层沉积物中砷及其他重金属含量分布的重要因素,粒径与砷及其他重金属显著相关性不强,影响较小.（4）柱状沉积物中总砷含量范围为9.15～13.61μg/g,随深度的变化不明显,人为污染程度较轻.（5）柱状沉积物中As3＋含量介于2.45～5.35μg/g之间,As5＋含量范围为5.58～11.77μg/g,二者含量随深度的增加而降低.     

基于水质浮标在线监测的米氏凯伦藻赤潮过程及环境因子变化特征分析

相较于船舶走航监测, 海洋水质浮标在线监测的优势在于能够获取目标海域长期、连续监测数据, 能更好地反映环境状况的动态变化。为了厘清米氏凯伦藻赤潮的发生、发展动态, 本文以2017年6月南麂附近海域米氏凯伦藻赤潮为例, 分析海洋水质浮标获取的连续监测数据, 探讨米氏凯伦藻赤潮过程叶绿素a和水环境因子动态变化特征及其与气象要素的关系。赤潮期间, 水温为22.8~26.0℃、盐度为28.8‰~31.8‰、气温为20.4~27.3℃, 该温盐范围均适宜米氏凯伦藻的细胞生长; 较高的光照强度能够支持较高的藻类细胞密度。Pearson相关性分析显示, 米氏凯伦藻细胞密度与叶绿素a浓度呈显著正相关; 溶解氧(DO)及其饱和度(DO%)、pH、水温、气温等环境因子与叶绿素a浓度呈极显著正相关, 盐度与叶绿素a浓度呈极显著负相关。向岸风生海流有利于藻种向近岸较高营养区域汇集, 为赤潮的爆发创造有利条件。赤潮过程中, 叶绿素a浓度、溶解氧饱和度、pH发生了协同变化, 据此特征可以开展赤潮短期预警。     

九龙江河口区稀土元素地球化学特征

用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）对2007年10月航次采集的九龙江河口区溶解态、悬浮颗粒态、沉积物样品中的稀土元素（REEs）进行了测定,对REEs的地球化学特征进行研究.结果表明,REEs在各相态中的含量范围如下：溶解态的为0.1 ng/dm^3（Eu）～1.96μg/dm^3（Ce）,悬浮颗粒态的为0.28（Tm）～142.83（Ce）mg/kg,沉积物的为0.25（Tm）～99.65（Ce）mg/kg;溶解态、悬浮颗粒态及沉积物中REEs球粒陨石标准化配分曲线均表现为负斜率型,九龙江河口为LREE相对HREE富集型河口.九龙江河口溶解态、悬浮颗粒态、沉积物三相态中REEs含量受流域土壤、地表径流等源区因素影响较大.Ce异常值在各相态中表现为负异常.     

九龙江河口湾泥沙运移特点与沉积动力机制

本文研究了九龙江河口湾的泥沙动物特点与沉积动力机制。结果表明：（１）泥沙主要来地河流输沙和潮流输沙;潮流输沙星明显大于河流输沙星;涨潮输沙星通常大于落潮输沙量;潮流输沙在枯水期尤为显著,而河流输沙则集中在洪水期。（２）底沙推移运动主要发生在水道床面,系局部冲刷所致;推移质输沙表现为沙洲推移,沙嘴延伸或水下沙体游移,研究发现,在涨潮流占优势的鸡屿北水道有反向,推移质输输沙的迹象。（３）自６０年代以来