氮、磷源浓度对裂殖壶菌生长及油脂积累的影响

裂殖壶菌是替代深海鱼油产业化生产二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)油脂的极具潜力的微生物。该研究采用1株裂殖壶菌DP-16发酵产油脂,以葡萄糖为碳源,以酵母浸粉和谷氨酸钠为氮源,以KH₂PO₄为磷源,探究了氮、磷源浓度对菌体生长、葡萄糖消耗和油脂积累的影响。结果显示,在正常氮、磷源浓度下培养菌体,0～24 h为细胞增殖期,24～84 h为油脂积累期,在84 h油脂产量和油脂含量分别达到14.1 g/L和33.5%,84～96 h进入油脂反耗期。改变氮、磷源浓度,低磷条件下72 h的油脂产量和油脂含量分别达到14.8 g/L和44.3%,比对照组分别提高了5.0%和32.2%,而高氮、低氮、高磷等条件均不利于裂殖壶菌产油脂。研究结果表明,氮、磷源浓度对裂殖壶菌细胞生长和油脂积累产生重要影响,油脂产量取决于菌体生物量和细胞内油脂含量的乘积,为提高油脂产量,需要在获得高细胞浓度(生物量)和达到高油脂含量之间找到一个合适的平衡,以确定适宜的氮、磷源浓度。该研究对促进裂殖壶菌发酵产DHA油脂具有重要参考意义。     

裂殖壶菌油脂成分及抗氧化活性分析

为研究裂殖壶菌油脂成分及抗氧化活性,本文采用气相色谱-质谱和核磁共振技术分别对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成和脂质成分进行分析,并对油脂的自由基清除能力和总抗氧化能力进行测定。结果表明：裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成简单,主要为C14:0(13.22%)、C16:0(26.78%)、C22:5n-6(DPA,13.66%)和C22:6n-3(DHA,42.04%);其脂质成分以甘油三酯为主,含有少量游离脂肪酸,且C22:6n-3和C22:5n-6等多不饱和脂肪酸主要结合于甘油三酯的sn-2位。同时,裂殖壶菌油脂具有较好的DPPH、ABTS⁺和羟基等自由基清除能力和总抗氧化能力,且在10～50 mg/mL质量浓度范围内呈现显著的量效关系(P<0.05)。裂殖壶菌油脂富含C22:6n-3和较好的抗氧化活性,具有较高的营养价值和功能油脂开发潜力。本研究为裂殖壶菌油脂成分分析、抗氧化活性评价以及功能性油脂开发提供了理论依据。     

裂殖壶菌油脂水酶法提取工艺优化及其脂肪酸组成分析

采用水酶法对裂殖壶菌油脂的提取工艺进行研究,通过单因素和正交实验优化提取工艺条件,并对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成进行分析。实验结果表明,水酶法提取裂殖壶菌油脂的最佳工艺条件:复合酶配比2∶8(纤维素酶∶中性蛋白酶,U∶U),液料比4 m L/g,加酶量2 500 U/g,酶解温度55℃,酶解时间4h;在此优化条件下,裂殖壶菌油脂提取率为82.47%。裂殖壶菌油脂脂肪酸以C14∶0、C16∶0、C22∶5n-6和C22∶6n-3为主,其脂肪酸组成简单,且C22∶6n-3质量分数高达32.65%,表明裂殖壶菌油脂具有很高的营养价值和功能性油脂的开发潜力,可作为C22∶6n-3的重要食药来源。     

葡萄糖亚适量补加胁迫裂殖壶菌胞内类胡萝卜素积累

为探究裂殖壶菌积累类胡萝卜素的营养胁迫调控手段,考察了发酵中期(72 h起),不同葡萄糖补加质量浓度、酵母提取物补加质量浓度对裂殖壶菌生长、油脂合成和类胡萝卜素合成的影响。结果表明:仅补加较低质量浓度葡萄糖时,裂殖壶菌生物量和油脂产量虽较低,但胞内类胡萝卜素含量较高;在5 L发酵罐中、发酵中期,采用溶氧反馈控制葡萄糖流加策略,人为制造葡萄糖亚适量补加条件,在发酵98 h时胞内类胡萝卜素含量达到最大,为151.0μg/g,相比葡萄糖充足供应条件下的水平提高了4倍以上。综合发酵实验结果和裂殖壶菌代谢途径分析,可推测:油脂合成期葡萄糖亚适量补加可限制细胞生长、弱化裂殖壶菌胞内油脂合成途径,胁迫碳源流向类胡萝卜素合成途径,促进类胡萝卜素的大量积累。     

裂殖壶菌单细胞油脂的组分特性分析

为了获得完整的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)油脂组分信息,以其单细胞油脂组分为研究对象,对裂殖壶菌单细胞油脂进行深入研究.结果表明:裂殖壶菌单细胞油脂占细胞干重的63.32％;单细胞油脂由87.864％的中性脂和11.322％的极性脂组成;单细胞油脂中DHA含量为41.45％;单细胞油脂中胆固醇、角鲨烯和β-胡萝卜素含量分别为40.93、19.99 mg/g和34.91 μg/g.经气相色谱-质谱联用分析表明:单细胞油脂的不皂化物中含有胆固醇、麦角固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇和角鲨烯.     

使用稀禾定驯化提高裂殖壶菌的生长和DHA积累

采用基于实验室的微生物适应性驯化方法,对Schizochytrium sp.S31进行脂肪酸合成途径抑制剂稀禾定连续传代驯化,逐步提高稀禾定的驯化浓度。经过近200天连续驯化65代,Schizochytrium sp.S31对稀禾定的耐受浓度从200μmol/L提高到了500μmol/L。通过250 m L摇瓶发酵96 h后发现,驯化株的生物量明显高于野生株的生物量,其中驯化株ALE500的生物量最高,比相同时间点野生株的生物量高20.2%,二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)产量也提高了30.4%。此外,驯化株的脂肪酸不饱和度也有所提高,其中驯化株ALE500的不饱和度达到了1.11。采用5 L发酵罐验证驯化效果,结果显示驯化株ALE500的生物量和DHA产量分别提高了19.74%和29.38%。综上所述,使用脂肪酸合成途径抑制剂稀禾定对裂殖壶菌进行定向驯化的方法可以提高裂殖壶菌的发酵生物量和DHA产量。     

面向工业化的裂殖壶菌DHA油脂提取方法研究

研究液氮法、均质法、微波法、酶法等9种细胞破碎方法对裂殖壶菌单细胞油脂提取的影响,分别考察了各种细胞破碎方法提取得到的单细胞油脂含量、DHA含量、油脂中的脂肪酸分布以及耗时、耗能等情况,结果表明酶法和酸热法效果最好,其中酶法由于投入低、能耗少、操作简单等优点更具工业化潜力。将酶法与传统的均质法进一步放大对比,验证了酶法的优良性能。     

裂殖壶菌胞内油脂尼罗红荧光染色快速检测方法的研究北大核心CSCD

为了建立快速检测裂殖壶菌胞内油脂的方法,探讨了尼罗红荧光染色法检测裂殖壶菌油脂含量的检测条件。通过考察裂殖壶菌重悬液中添加二甲基亚砜体积分数、尼罗红染液用量、染色温度、染色时间及细胞密度对荧光强度的影响,确立最优检测条件,进一步考察细胞油脂含量与荧光强度的关系,从而建立尼罗红荧光检测法的定量关系。结果表明,最优检测条件为：每毫升裂殖壶菌重悬液中二甲基亚砜体积分数和尼罗红染液用量分别为25%和15μL,染色温度50℃,染色时间15 min。在最优检测条件下,细胞密度不超过0.218×10^8个/m L范围内,菌液油脂含量（X）与荧光强度（Y）呈现良好的线性关系,其线性关系式为Y=798.55X-3.44,相关系数R2为0.996 4。因此,采用尼罗红荧光染色法可以快速检测裂殖壶菌的油脂含量。     

不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响

研究不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响。用干重法测定裂殖壶菌的生物量,溶剂法提取油脂,并用GC分析DHA含量。结果表明:最适初始葡萄糖质量浓度和氮源质量浓度分别为80、15 g/L;菌种在26℃下培养48 h后,再将发酵温度降到22℃下培养120 h,其DHA含量为43.62%,DHA产量为5.23 g/L。在最佳条件下,50 L放大培养(先26℃培养48 h,后22℃培养96 h)后油脂产量可达14.8 g/L,DHA产量可达6.5 g/L。综上所述,裂殖壶菌具有较好的工业化生产潜力。     

维生素对裂殖壶菌发酵产DHA的影响

采用单因素研究了VB1,VB3,VB6,VB12,生物素5种B族维生素对裂殖壶菌Schizochytriumsp.JN-168发酵产DHA的影响。实验表明:适量地添加5种维生素中的任一种均可提高DHA的产量,5种维生素的最适的质量浓度分别为0.1,0.005,0.005,0.3,0.05 mg/L,在各自最适的质量浓度下,VB12对DHA产量的提高效果最好,VB6和VB3次之,生物素和VB1最差。将5种维生素以最适的质量浓度同时添加到发酵培养基中可以大幅度提高DHA产量,与对照相比提高了53.8%,亦远高于添加单一维生素的效果。     

生物柴油副产物甘油中磷脂酰胆碱的提限纯化研究

以生物柴油副产物甘油中分离得到的粗磷脂为原料,采用乙醇提取、减压蒸馏浓缩制备较高纯度磷脂酰胆碱(PC).通过响应曲面设计考察了料液比、提取温度、提取时间、搅拌速度对提取率的影响.优化的最佳提取条件为:液料比42:1(mL/g),提取温度46℃,提取时间38min,搅拌速度328r/min,提取一次.经实验验证,提取率达到78.2%,Pc含量由原来的46%提高到77%.     

从生物柴油副产物甘油中分离磷脂的研究

以生物柴油副产物甘油为原料,用丙酮为溶剂分离得到丙酮不溶物(粗磷脂).研究了液料比、提取分离温度、提取分离时间和搅拌速度对提取率的影响.用响应面法进行优化,最佳分离条件为:V(无水丙酮):m(甘油)为12:1,提取分离温度16℃,提取分离时间13 min,搅拌速度372r/min.经验证实验,提取率达到98.9%.     

氮、磷浓度对小球藻生长及油脂积累的影响

含油微藻是非常有前景的生产生物柴油的材料,其生物量和油脂含量是决定其经济可行性的重要指标。培养基组成对含油微藻的生长与油脂积累具有重要影响。实验以采自青岛海域的一株海水小球藻为研究对象,在摇瓶中考察培养基氮源、磷源浓度对小球藻生长及其油脂积累的影响。结果表明:在一定范围内,增加氮源浓度能提高小球藻生长速率,但磷源对小球藻生长影响不明显;随着氮、磷源浓度的降低,小球藻总脂和中性脂含量均逐渐增大,氮源起的作用更加显著,在0.220mmol/L的低氮胁迫下获得了最高的细胞总脂含量,总脂占细胞干重的33.5%±0.3%。氮源浓度为0.441mmol/L时,小球藻的油脂产率最高,为(10.58±0.29)mg·L-1·d-1。培养基中低磷浓度有利于小球藻的油脂积累,但差别不明显。     

氮对纤维藻生长、油脂积累及营养吸收的影响

为研究氮源及氮浓度对一株淡水富油纤维藻（Ankistrodsemus sp.）生长、油脂积累及营养吸收的影响。以3N-BBM为基础培养基,采用单因素实验分别考察了尿素、氯化铵、硝酸钠及亚硝酸钠以及硝酸钠浓度对纤维藻生长、油脂积累及营养吸收的影响。结果表明:四种氮源对纤维藻生长和生物量影响较小,但对油脂积累影响较大。该藻在尿素中的生物量浓度最高（2.87g/L）,在硝酸钠中的油脂含量（30.17%）和油脂产量（0.81g/L）最高。硝酸钠浓度为0.3mmol/L时,该藻较难存活,浓度为3.0mmol/L时其生长较差,但油脂含量（37.37%）和油脂产量（0.89g/L）最高;浓度在9.0³0.0mmol/L时,纤维藻生物量较高,但油脂含量和油脂产量较低。综合生物量和油脂含量考虑,该纤维藻最适生长和油脂积累的氮源为硝酸钠且最适浓度为3.0mmol/L。      

添加不同营养物质对裂殖壶菌油脂反耗期磷脂DHA含量的影响

研究油脂反耗过程中不同营养物质的添加对裂殖壶菌胞内油脂含量、油脂组分及各油脂组分中DHA含量的影响,开发一种能够有效提高胞内油脂中磷脂DHA含量的营养物质添加方法。结果表明:单营养物质添加实验发现谷氨酸钠、乙醇可以有效缓解反耗期油脂含量的降低;磷酸二氢钾、乙醇、硫酸铵可以有效提高胞内极性脂的含量;酵母膏、硫酸铵可以有效提高极性脂中DHA的含量。多种营养物质复配添加实验发现,谷氨酸钠-磷酸二氢钾复配添加效果最佳,添加后,胞内油脂含量维持在26.65 g/L,与未添加营养物质相比,提高了44.52%;其中极性脂占总油脂的49.08%,极性脂中DHA含量达到54.65%,PUFA与SFA比值为4.48。     

不同营养条件对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长和油脂积累的影响

为优化微藻培养条件,以BG11为基础培养基,采用单因素实验考察了不同质量浓度的NaNO₃、K₂HPO₄、Na₂CO₃和CaCl₂·2H₂O对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长和油脂积累的影响。结果表明:NaNO₃、K₂HPO₄、Na₂CO₃和CaCl₂·2H₂O对微藻Ankistrodesmus sp.CJ09生长、油脂含量和油脂产量影响显著(p<0.05),且NaNO₃、K₂HPO₄、Na₂CO₃和CaCl₂·2H₂O的质量浓度分别为0.75、0.02、0.08、0.018 g/L时,最利于微藻Ankist...     

裂殖壶菌在不同氧供应条件下油脂及大分子物质迁移规律研究

为研究裂殖壶菌在不同供氧条件下胞内油脂、碳水化合物、蛋白质、多糖和寡糖的迁移规律,将传统方法与傅里叶红外光谱法相结合,研究发酵过程中各物质迁移规律。结果表明:傅里叶红外光谱法是一种可信且快速的检测手段;油脂积累过程中三酰甘油(TAG)、寡糖相对含量均随时间的延长而增加;碳水化合物呈先升高后降低趋势;多糖相对含量在低供氧条件下随时间的延长而增加,高供氧条件下与之相反。此外,高供氧条件下可积累富含95.74%中性脂的油脂;低供氧条件下细胞倾向于积累极性脂、蛋白质并快速富集寡糖成分以应对不良环境。