Aβ（31—356）和ApoE4对培养大鼠海马神经元的存活和生长的影响

为探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)和载脂蛋白E4(ApoE4)对培养大鼠海马神经元的作用,本文采用了神经细胞培养、MTT比色法、免疫组化及图象分析等技术进行了研究.结果显示(1)MTT法测得Aβ(31-35)(10 μmol/L)+ApoE4(10μg/ml)和Aβ(31-35)(20 μmol/L)+ApoE4(10 μg/ml)的OD值,分别为0.197±0.021和0.191±0.024,明显低于对照组(0.229±0.03,P＜0.05).(2)这两组神经元胞体的最长径分别为(10.07±1.98)μm和(10.01±1.68)μm;最短径分别为(6.40±0.77)μm和(6.28±0.89)μm,明显低于对照组、ApoE4组、Aβ(31-35)组的最长径和最短径(P＜0.05);其突起平均长度分别为(26.36±7.73)um和(23.86±7.29)μm,明显低于对照组(30.88±9.79)μm、ApoE4组(30.60±7.30)μm以及Aβ(31-35)(10 μmol/L)组(28.34±4.40)μm(P＜0.05).(3)Aβ(31-33)(20 μmol/L)组的突起平均长度为(26.81±5.42)μm,也明显低于对照组(30.88±9.79)μm和ApoE4组(30.60±7.30)μm(P＜0.05).本研究结果提示,Aβ(31-35)+ApoE4对神经元的抑制作用较Aβ(31-35)强,ApoE4对Aβ(31-35)的神经毒性效应可能有协同作用.     

β—淀粉样蛋白31—35和载脂蛋白E4对大鼠海马神经元存活和生长的影响

目的 :研究 β 淀粉样蛋白 (Betaamyloidpritein ,Aβ)与载脂蛋白E4(ApolipoproteinE ,ApoE4)对神经元的共同作用 ,探讨老年性痴呆发病的细胞分子机制。材料与方法 :体外培养神经细胞 ,采用MTT比色法和免疫组化标记 ,结合图像分析技术 ,研究Aβ3 1 3 5和ApoE4对海马神经元存活和生长的作用。结果 :(1 )Aβ3 1 3 5(1 0 0 μmol/L) +ApoE4(1 0 μg/ml)和Aβ3 1 3 5(2 0 μmol/L) +ApoE4(1 0 μg/ml)的OD值 ,分别为 0 .1 97± 0 .0 2 1和 0 .1 91± 0 .0 2 4,明显低于对照组 0 .2 2 9± 0 .0 0 3 μm(P <0 .0 5 )。 (2 )这两组神经元胞体的最长径分别为 1 0 .0 7± 1 .98μm和 1 0 .0 1± 1 .68μm ;最短径分别为 6.40± 0 .77μm ,6.2 8± 0 .89μm ,明显低于对照组 1 2 .73± 3 .0 0 μm、7.0 5± 1 .0 4μm ,Aβ3 1 3 5组 1 2 .0 9± 2 .45 μm、7.0 1± 1 .0 2 μm ,最长径和最短径 (P <0 .0 5 ) ;(3 )两组神经元突起平均长度分别为 2 6.3 6± 7.73 μm和2 3 .86± 7.2 9μm ,明显低于对照组 3 0 .88± 9.79μm、2 8.3 4± 4.40 μm ,P <0 .0 5。 (4 )Aβ3 1 3 5(2 0 μmol/L)组的平均突起长度 (2 6.81± 5 .42 μm) ,明显低于对照组和ApoE4组 3 0 .60± 7.3 0 μm(P <0 .0 5 )。ApoE4对海马神经元的存     

Aβ31-35和ApoE4对体外大鼠基底前脑神经元存活和生长的协同作用

目的　探讨 β-淀粉样蛋白 (Aβ)和载脂蛋白 (Apo E4)对基底前脑神经元存活和生长的影响 ,研究Alzheimer病 (AD)发病的细胞分子机制。　方法　体外培养基底前脑神经细胞 ,MTT法和免疫细胞化学方法结合体视学分析 ,观察 Aβ31- 35和 Apo E4对基底前脑神经元存活及胞体和突起生长的影响。　结果　 (1) MTT法测得的 Aβ- 31- 35 Apo E4组的 A值 ,与对照组比较明显减小 (P<0 .0 5 ) ,说明神经元的存活力降低 ,存活数量减少 ;(2 )Aβ31- 35 Apo E4组的神经元胞体最长径和最短径明显低于对照组和 Apo E4组 (P<0 .0 5 ) ;平均突起长度也明显低于对照组、Apo E4组和 Aβ31- 35 (10 μmol/ L)组 (P<0 .0 1) ;(3) Aβ31- 35 (2 0 μm ol/ L)组平均突起长度比对照组、Apo E4组和 Aβ31- 35 (10 μmol/ L)组明显减小 (P<0 .0 1) ;(4) Aβ31- 35 Apo E4组和 Aβ31- 35 (2 0 μm ol/ L)组的胆碱能神经元最长突起长度、总突起长度及平均突起长度均明显低于对照组 (P<0 .0 1) ;且这两组的 Ch AT阳性神经元的胞体平均灰度也明显低于对照组 (P<0 .0 5 ) ,说明 Ch AT的活性下降。单独 Apo E4对基底前脑神经元的存活和生长均无明显影响。　结论　 Aβ31- 35 Apo E4比单独 Aβ31- 35对神经元存活及胞体和突起生长的抑制作     

S14G-Humanin对Aβ_(31-35)所致大鼠行为学及神经元凋亡的影响

目的:研究S14G-Humanin对Aβ31-35所致大鼠行为学及神经元凋亡的影响。方法:SD大鼠60只随机分为5组,经侧脑室分别注入生理盐水(对照组)、Aβ31-35(Aβ31-35组),Aβ31-35+HNG(0.01 mmol/L),Aβ31-35+HNG(0.1 mmol/L)和Aβ31-35+HNG(1 mmol/L)。注射第7 d行Morris水迷宫实验观察各组大鼠的行为学改变;注射12 d后处死大鼠,应用TUNEL法检测各组海马神经元的凋亡情况,应用免疫组化法检测神经元caspase-3的表达。结果:与对照组相比,Aβ31-35组大鼠的学习、记忆能力明显下降(P<0.05),Aβ31-35+HNG(0.1,1 mmol/L)组大鼠的学习、记忆能力有所改善,与Aβ31-35组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Aβ31-35组海马神经元的凋亡指数及caspase-3阳性细胞数均高于正常对照组,Aβ31-35能引起大鼠海马神经元的凋亡及学习、记忆能力的下降;Aβ31-35+HNG(1,0.1,0.01 mmol/L)组凋亡指数及caspase-3阳性细胞数均明显下降,与Aβ31-35组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:S14G-Humanin对Aβ31-35诱导的大鼠海马神经元凋亡及行为学改变具有保护作用。     

脑神经肽类似物Rattin对β-淀粉样蛋白所致大鼠海马神经元损伤的影响

目的:探究Humanin衍生物Rattin拮抗Aβ_(31-35)所致在体海马theta节律紊乱及离体细胞损伤的保护作用及其机制。方法:将SD大鼠随机分为4组(vehicle+saline、vehicle+Aβ_(31-35)、Rattin+saline以及Rattin+Aβ_(31-35)),大鼠海马区注射Aβ_(31-35)/Rattin后,利用微电极记录在体海马局部场电位;分离培养SD大鼠乳鼠原代海马神经元,利用CCK-8法检测Aβ_(31-35)/Rattin处理后细胞活性,利用激光共聚焦显微镜荧光成像技术观察细胞内[Ca~(2+)]、利用real-time RT-PCR检测MAPK、PI3K以及STAT3的表达。结果:(1) Aβ_(31-35)抑制了大鼠海马CA1区的theta节律,Rattin处理可拮抗Aβ_(31-35)所致的theta节律压抑;(2)单独给予Rattin不影响原代海马神经元的存活率,但中等浓度(10μmol/L)或高浓度(100μmol/L)的Rattin明显保护了海马神经元免受Aβ_(31-35)引起的细胞伤害,该效应可被酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein完全逆转;(3)单独注射Aβ_(31-35)使海马神经元STAT3 mRNA表达下调、p38MAPK和PI3K mRNA表达增加,联合给予Rattin则阻止了STAT3 mRNA的下调,但对p38MAPK和PI3K mRNA表达没有影响;(4) Rattin预处理抑制了Aβ_(31-35)诱发的细胞内[Ca~(2+)]升高,此效应可被JAK抑制剂AG490所阻断。结论:Rattin能够有效减轻Aβ_(31-35)引起的海马theta节律压抑和剂量依赖性拮抗Aβ_(31-35)所致的细胞毒性。这些神经保护作用与Rattin对JAK/STAT3信号转导途径的激活以及细胞内Ca2+稳态的维持有关。     

Humanin拮抗Aβ_(31-35)诱导的神经元凋亡

为了研究Humanin(HN)对Aβ31-35诱导的大鼠皮层神经元凋亡的影响,本研究采用原代培养的大鼠皮层神经元,应用流式细胞术、TUNEL法、HO33342染色法检测不同时间(0、8、16h)加入不同浓度的HN对Aβ31-35致神经元凋亡的影响。结果显示:Aβ31-35(25μmol/L)引起培养皮层神经元的凋亡率明显增高,神经元凋亡率由7.43%上升到32.69%;凋亡指数由6.87%上升到28.36%(P<0.05)。与Aβ31-35同时或提前8h给予不同浓度(5,10,20μmol/L)的HN对Aβ31-35(25μmol/L)诱导的神经元凋亡均未产生影响;但20μmol/L的HN提前16h孵育可明显抑制Aβ31-35所致的神经元凋亡,其凋亡率由32.69%下降到20.36%,凋亡指数由28.36%下降到17.57%。本研究结果提示,HN拮抗Aβ31-35致神经元凋亡作用具有剂量和时间依赖性。     

二十二碳六烯酸降低β淀粉样蛋白25-35致大鼠皮质神经元损伤

目的观察二十二碳六烯酸(DHA)对β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)致原代培养大鼠皮质神经元损伤的保护作用。方法原代培养Wistar大鼠皮质神经元,先后给予不同剂量的DHA(20、50和100μmol/L)及Aβ25-35(25μmol/L),用CCK-8比色法观察神经元存活率,用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内游离钙离子浓度。结果 1)与对照组相比,Aβ25-35使细胞存活率明显下降(31%±6%,P<0.05);使细胞内游离钙离子浓度明显升高(249%±12%,P<0.05);2)孵育DHA可降低Aβ25-35引起的神经元存活率明显下降及细胞内游离钙离子浓度升高。结论 Aβ致细胞内钙超载是Aβ产生神经毒作用的一个方面,而DHA可部分拮抗Aβ25-35的神经毒作用。     

银杏内酯B对胆固醇和apoE4共处理海马神经元APP的影响

目的探讨银杏内酯B对高胆固醇和apoE4共损伤海马神经元APP基因和蛋白水平的影响。方法应用高胆固醇和apoE4共处理海马神经元,形成高胆固醇细胞损伤模型。采用实时定量RTPCR的方法检测APP mRNA的表达,采用Western-blot测定APP蛋白水平。结果高胆固醇可以上调APP mRNA的表达,提高APP蛋白水平;银杏内酯B下调APP mRNA和蛋白水平的基因表达。结论高胆固醇可以通过促进β-淀粉样蛋白形成,参与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发生、发展,银杏内酯B可以有效抑制β-淀粉样蛋白形成,为AD的治疗提供了一个可行途径。     

β-淀粉样蛋白25-35对培养的大鼠隔区神经元存活和生长的影响

目的：探讨β－淀粉样蛋白对隔区神经元的作用。方法：采用神经细胞培养技术、ＭＴＴ法、免疫细胞化学及图像分析技术,观察“老化”及正常的β－淀粉样蛋白２５－３５片段对隔区神经元存活、生长及胆碱能神经元胞体中胆碱乙酰转移酶活性的影响。结果：“老化”的β－淀粉样蛋白２０ｕｍｏｌ／Ｌ组的隔区神经元光密度值及突起长度比对照组,１０ｕｍｏｌ／Ｌ组及未“老化”的２０ｕｍｏｌ／Ｌ组均明显;胆碱能神经元的突起长度及胞体     

NS398对Aβ肽损伤原代培养海马神经元的影响

目的:探讨Cox-2抑制剂NS398对损伤神经元的保护作用。方法:将原代培养的SD大鼠海马神经元随机分为空白对照组、Aβ肽细胞模型组和NS398实验组。以10μmol/L Aβ25-35制作原代培养海马神经元损伤模型,以四氮唑溴盐(MTT)比色法检测细胞存活率,免疫细胞化学法检测Cox-2、Caspase-3的表达。结果:Aβ25-35细胞模型组神经元形态变化明显,细胞存活率明显下降,Cox-2和Caspase-3表达增强,与空白组比较有显著差异(P<0.01)。NS398使神经元细胞存活率明显提高并使Cox-2和Caspase-3表达减弱,与Aβ肽模型组比较具有显著性差异(P<0.01)。结论:Aβ25-35导致Cox-2和Caspase-3的表达增强,并使SD大鼠原代培养海马神经元变性、死亡。NS398可能通过抑制Cox-2和Caspase-3的表达保护原代培养海马神经元。     

Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ_(31-35)诱导的HT22海马神经细胞per1基因异常表达

目的:探讨Exendin-4对Aβ_(31-35)所致的HT22神经细胞per1基因异常表达的影响及可能作用机制。方法:本研究采用海马神经细胞HT22作为实验对象。以1%血清饥饿1 h来诱导细胞同步化(CT0)。MTT实验检测细胞存活率;倒置显微镜下观察细胞形态变化;Real-time PCR检测各CT时间per1基因的表达变化;选择per1表达差异最显著的CT时间点,采用流式细胞术检测细胞内钙离子浓度的变化情况。结果:(1)Exendin-4可以明显提高Aβ_(31-35)所致的HT22细胞存活率的下降;(2)镜下观察可见,经Exendin-4预处理后部分改善了Aβ_(31-35)对细胞的损伤作用,细胞形态有所恢复;(3)Aβ_(31-35)使per1基因在CT16时各处理组的相对表达量明显不同;与对照组相比,Aβ_(31-35)使per1基因表达量明显升高;经Exendin-4预处理后,per1基因的表达得到一定程度的恢复,差异具有统计学意义;(4)在CT16时各处理组细胞荧光强度值明显不同,与对照组相比,Aβ_(31-35)使细胞荧光强度明显增强;经Exendin-4预处理后,细胞荧光强度值明显降低,差异具有统计学意义,此结果与加入尼莫地平的结果类似。加入尼莫地平预处理后,检测各个CT时间per1基因表达变化,与Exendin-4预处理组得到的结果类似。结论:Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ_(31-35)诱导的HT22海马神经细胞per1基因的异常表达。     

β淀粉样蛋白1-42对大鼠海马神经元树突棘的影响

目的:研究β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)对于原代培养的大鼠海马神经元树突棘形态和数量的影响.方法:将原代培养的新生大鼠海马神经元随机分为对照组(control)和Aβ1.42处理组(Aβ1-42),用浓度为500 nmol/L的Aβ1-42处理细胞,应用免疫荧光染色检测树突棘上大脑发育调节蛋白(drebrin)的...     

雷帕霉素改善Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱

目的:观察大环内酯类抗生素雷帕霉素(Rapa)对β-淀粉样蛋白31-35(Aβ31-35)引起的C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱及小鼠海马神经元细胞系HT22中Per2表达异常的影响。方法:选取6～8周雄性C57BL/6小鼠进行跑轮行为学实验,分析Rapa在改善Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱中的作用。将HT22神经细胞随机分为对照组、Aβ31-35组、Rapa预处理组和Rapa单独处理组,CCK-8法检测细胞活力。采用real-time PCR法检测上述各组细胞于circadian time(CT)4、CT8、CT12、CT16、CT20和CT24的Per2 mRNA表达水平,通过Western blot方法检测Per2 mRNA表达差异最大时点CT16的PER2蛋白表达水平。结果:与对照组相比,Aβ31-35引起小鼠昼夜节律紊乱,自由运转周期显著延长;Rapa预处理后,小鼠的昼夜节律紊乱情况有所改善,自由运转周期显著降低。Aβ31-35引起HT22细胞活力显著降低且具有剂量依赖性;Rapa预处理后有效逆转Aβ31-35诱导的HT22细胞存活率下降(P0.05)。经Aβ31-35处理后,HT22细胞Per2的mRNA水平在CT16处较对照组明显降低;Rapa预处理后Per2的mRNA异常表达得到显著改善。与对照组相比,Aβ31-35组CT16时Per2蛋白水平显著降低;与Aβ31-35组相比,Rapa预处理组Per2蛋白水平在一定程度上升高(P0.05)。结论:Rapa可以有效缓解Aβ31-35所致C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱,并有效改善Aβ31-35所致HT22细胞中Per2的异常表达。     

脑内注射Aβ_(25-35)未见对大鼠隔-海马胆碱能系统的毒性作用

本文运用ＣｈＡＴ 免疫组织化学方法和ＡＣｈＥ组织化学方法观察了Ａβ２５ ３５对大鼠隔 海马胆碱能系统的影响。结果如下：Ａβ２５ ３５注射入内侧隔核，存活１４ ｄ，内侧隔核ＣｈＡＴ 阳性细胞和其支配靶区海马ＡＣｈＥ 阳性纤维的形态和数量未见明显变化；Ａβ２５ ３５注射入海马，存活１４ ｄ，注射点附近ＡＣｈＥ纤维和同侧内侧隔核ＣｈＡＴ 阳性细胞也未见明显变化。上述结果显示，在目前实验条件下，脑内注射Ａβ２５ ３５对大鼠隔 海马胆碱能系统没有明显影响。结合文献讨论，本文作者认为：Ａβ对中枢胆碱能系统是否具有毒性作用还有待进一步探索。     

神经生长因子对Aβ1-40诱导海马神经元周期蛋白异常表达的影响

为了探讨神经生长因子(NGF)对β-淀粉样蛋白诱导海马神经元周期蛋白表达的影响。本研究取新生3d内大鼠海马细胞行体外培养7d,分别在加入Aβ1-40前后加入NGF和等体积培养液,采用β-tubulin、ChAT免疫组化、cyclin免疫荧光进行检测。β-tubulin免疫组化证实所培养的为特异性结构完整的海马神经元;cyclin免疫荧光检测、ChAT免疫组化显示Aβ1-40导致cy-clin A、cyclin B1水平显著增高及ChAT免疫阳性细胞明显减少;而给予NGF可在不同程度上降低cyclin A、cyclin B1蛋白水平,增加ChAT免疫阳性细胞。结果提示,NGF能有效地阻止和轻度地修复Aβ1-40诱导的海马细胞损伤,对Aβ引起的海马神经元内异常表达细胞周期蛋白有一定的抑制作用。     

Exendin-4对Aβ_(1-42)所致大鼠在体海马长时程增强抑制的拮抗作用及机制

目的:研究2型糖尿病(T2DM)治疗药物Exendin-4拮抗β-淀粉样蛋白(Aβ)抑制大鼠在体海马长时程增强(LTP)的作用及机制。方法:将SD大鼠随机分为对照、Aβ1-42、Exendin-4、Exendin-4+Aβ1-42四组(n=8)。利用自制的刺激/记录/给药一体化装置记录大鼠在体海马CA1区LTP;通过免疫组化实验观察大鼠海马CA1区p-CREB、p-Ca MKIIα和p-Akt的表达情况。结果:(1)海马CA1区注射Aβ1-42能显著抑制LTP的诱导和维持,高频刺激(HFS)后场兴奋性突触后电位(f EPSPs)平均幅度较对照组明显降低(P0.05);(2)与单独给予Aβ1-42相比,预先给予Exendin-4处理的f EPSPs平均幅度明显增加(P0.05);(3)Aβ1-42引起海马CA1区p-CREB、pCa MKIIα和p-Akt的表达降低,预先给予Exendin-4部分抑制了Aβ1-42诱导的p-CREB、p-Ca MKIIα和p-Akt表达下降。结论:海马内注射Exendin-4能够拮抗Aβ1-42引起的海马LTP损伤,其可能机制是通过改变c AMP/PKA/CREB信号通路、NMDA受体信号通路和PI3K/Akt/m TOR信号通路相关蛋白而实现。     

NMDA受体在β-淀粉样蛋白引起海马神经元突触蛋白改变中的作用

为了研究NMDA受体活性对Aβ引发的海马神经元突触蛋白表达变化的影响,本文运用免疫细胞化学方法检测不同浓度NMDA受体激动剂以及拮抗剂对Aβ诱导的海马神经元突触蛋白变化的影响。结果显示:NMDA可浓度依赖性地缓解Aβ25-35引起的突触蛋白synaptophysin与PSD-95的减少。抑制突触内NMDA受体,NMDA缓解Aβ减少突触蛋白的作用减弱;抑制突触外NMDA受体,对抗Aβ的作用无显著变化。本研究结果提示NMDA受体活性改变影响Aβ诱导的突触蛋白减少,突触内NMDA受体激活可对抗Aβ的毒性作用。突触内NMDA受体活性减弱可能在谷氨酸兴奋毒性中发挥作用。     

Aβ1-40诱导神经元凋亡过程中大鼠海马抗氧酶活性的变化

目的探讨β-淀粉样蛋白（Ap）通过氧化应激引起的细胞凋亡过程中，脑组织内抗氧酶活性的改变方式；并且通过过氧化氢酶（CAT）活性的变化，探讨过氧化物酶体在邯引起的氧化应激过程中的作用。方法将A口注射到大鼠海马，诱导细胞凋亡，在第3天和第7天观察超氧化物歧化酶（SOD）和CAT的活性变化。结果铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）和CAT的活性明显低于对照组，但其mRNA的表达各组之间没有差异；从第3天到第7天。总SOD的活性没有改变，但伴随着CAT和CuZn-SOD活性的恢复，丙二醛（MDA）的含量减少，大鼠的学习、记忆能力有所恢复。结论抗氧化酶活性的降低并非mRNA转录水平下降，可能是酶蛋白被活性氧（ROS）氧化所致；CAT发挥了比总SOD更为重要的抗氧化作用；过氧化物酶体在AD引起的氧化应激过程中发挥了抗氧化作用。     

白花丹参根制剂对AD大鼠学习记忆和海马CA1区神经元凋亡的影响

目的:探讨白花丹参根制剂对Aβ1-40诱导的AD模型大鼠学习记忆能力及海马CA1区神经元凋亡的影响。方法:采用双侧海马微量注射凝聚状态Aβ1-40诱导AD大鼠模型。测定白花丹参根制剂干预前后AD模型大鼠学习记忆能力,海马CA1区Ach含量、Ch AT和Ach E活性,海马神经元凋亡率以及海马区Bax和Bcl-2蛋白表达的变化。结果:与正常组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长,穿越站台次数和第三象限游泳时间减少,大鼠海马CA1区神经内Ach含量减少,而Ch AT和Ach E活性升高,同时海马CA1区神经元凋亡率增加,Bax蛋白表达水平上调,Bcl-2蛋白表达水平下调,Bcl-2/Bax比值降低。与模型组比较,治疗组大鼠逃避潜伏期缩短,穿越站台次数明显和第三象限活动时间增加,大鼠海马CA1区神经内Ach含量升高,而Ch AT和Ach E活性降低,同时海马CA1区神经元凋亡率降低,Bax蛋白表达水平下调,Bcl-2蛋白表达水平上调,Bcl-2/Bax比值升高。结论:白花丹参根制剂可有效提高AD模型大鼠学习记忆能力,其机制可能与改善胆碱能系统的功能、上调Bcl-2和下调Bax蛋白表达水平有关。