重组肝刺激因子对肝脏卵圆细胞增殖的作用

目的观察重组人肝刺激因子(hHSS)对肝脏卵圆细胞增殖的影响。方法分离大鼠肝卵圆细胞，加以培养，并进行细胞学鉴定。将重组的hHSS作用于肝脏卵圆细胞，以MTT法、流式细胞术观察其对卵圆细胞的增殖作用。结果实验分离的卵圆细胞同时表达肝细胞和胆管细胞特异性标志物。给予重组hHSS作用12～24h后，细胞增殖速度减缓，细胞DNA合成减弱，其作用的最有效浓度为240mg/L。结论重组hHSS能抑制卵圆细胞的增殖。     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

一种华支睾吸虫亲肌素样基因的克隆、表达与免疫学功能初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫亲肌素样蛋白（CsMLP）进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法应用生物信息学分析软件,分析CsMLP的序列特点和基本理化特征;将CsMLP基因克隆到原核表达质粒pET．28a（＋）中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsMLP蛋白免疫SD大鼠获得抗血清;用Westernblot进行免疫反应性及免疫原性分析;应用免疫荧光方法观察CsMLP在华支睾吸虫成虫的定位。结果该cDNA序列全长为900bp,编码190个氨基酸,具有Calponin功能域;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET．28a（＋）-CsMLP重组质粒构建成功;SDS—PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21／DE3中获得高效表达,分子量为21300Mr;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清、感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清识别;CsMLP主要定位于虫体富含肌肉组织的口、腹吸盘、咽部,在表膜、肠壁也有分布。结论CsMLP可在原核表达系统中呈现高效的可溶性表达,具有免疫原性．其主要分布在华支睾吸虫肌肉丰富的组织。     

大鼠肝卵圆细胞的诱导、分离及鉴定

目的建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型,并探索其分离及鉴定方法。方法雄性Wistar大鼠每天1次连续灌胃给予不同剂量二乙酰氨基芴(2-AAF熏5、10、15、20、25mg/kgBW),第5天行标准的2/3肝切除术,术后按各自剂量继续给予11天,不同时间取肝脏组织,行甲胎蛋白、细胞角蛋白18及19染色并观察。以确定的2-AAF最佳剂量制备大鼠肝干细胞增殖模型,Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化大鼠肝卵圆细胞,光镜、电镜下观察细胞特点,并进行上述细胞表型标志免疫组化染色。结果2-AAF15mg/kgBW能建立较理想的肝卵圆细胞增殖模型。HE染色可见汇管区及中央静脉周围大量增殖的嗜碱性小细胞,电镜下观察此种细胞具有卵圆形细胞核、细胞质少而淡、核/浆比例较大等特点,免疫组化染色证实甲胎蛋白、细胞角蛋白18和19染色阳性,白蛋白及白细胞共同抗原(LCA)染色阴性。分离所得底层细胞,光镜下表现大小不等、不规则圆形细胞,体积较小,细胞核/浆比例较大,电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,余同增殖细胞特点,免疫组化染色与增殖细胞表现相同细胞表型特点。结论本方法可成功诱导、分离、纯化大鼠肝卵圆细胞,符合肝卵圆细胞的形态特点、超微结构及细胞表型标志特点。     

华支睾吸虫感染患者血清Th1/Th2细胞因子水平检测及意义

目的研究华支睾吸虫病患者血清中Th1/Th2细胞因子IL-2和IL-4的水平变化,并探讨其在肝吸虫致病机制中的作用。方法分别采集华支睾吸虫病人和健康人的血清,用ELISA方法检测血清中Th1/Th2细胞因子IL-2和IL-4的水平。结果华支睾吸虫病人血清IL-2的水平与正常对照组相比(P<0.01)显著降低,IL-4的水平与正常对照组相比显著升高(P<0.05)。结论华支睾吸虫感染病人血清细胞因子水平异常,表现为Th1型细胞因子水平下降,Th2型细胞因子水平升高,病人细胞免疫功能下降,体液免疫功能增强升高,本研究结果表明肝吸虫感染后引起的细胞因子紊乱参与肝吸虫致病过程。     

NGF对癌性微环境下肝星状细胞的影响

目的 观察神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在癌性微环境下对肝星状细胞增殖和凋亡的影响.方法 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法筛选合适时间、稀释度的肝癌细胞上清液作为条件培养基;流式细胞仪(flow cytometer,FCM)、透射电镜观察NGF与条件培养基作用的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)细胞周期、凋亡率变化及超微结构改变; 结果 MTT显示48 h肝癌细胞上清液在1:2浓度时对HSC的促增殖作用最强;FCM显示在肝癌细胞条件培养基环境中随着NGF浓度增加HSC凋亡率增加,增殖无影响,透射电镜显示:在此环境下随NGF浓度增加HSC凋亡数目增多,并见不同时期的凋亡细胞.结论 NGF在癌性微环境下可以促进肝星状细胞凋亡.     

肝卵圆细胞的研究进展

肝卵圆细胞（OCs）是肝脏的干细胞,能够分化为肝细胞、胆管上皮细胞及其他细胞,亦与肝再生和肝脏疾病密切相关。本文简要地总结了近几年有关肝卵圆细胞的来源、定位、增殖、分化、凋亡、移植及在肝再生和肝脏疾病中作用等研究进展。     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子（RPEF）基因产物及抗RPEF多克隆抗体。方法亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEx4T-1,RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性。结果体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性。结论获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清。     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.     

肿瘤坏死因子a促进人冠状动脉内皮细胞的凋亡

背景：研究表明冠状动脉内皮细胞凋亡参与了动脉粥样硬化的发生、发展过程。 目的：观察肿瘤坏死因子a对人冠状动脉内皮细胞的诱导损伤作用。 方法：取对数生长期的人冠状动脉内皮细胞c-12221,分别加入含0(对照),200,400,600 mg/L肿瘤坏死因子a的培养液,采用MTT检测细胞增殖率变化,Hoechst 33258/PI双染观察凋亡细胞形态变化,Annexin V-FITC和PI双染流式检测细胞凋亡率变化,高内涵活细胞成像系统检测细胞线粒体膜电位变化。 结果与结论：肿瘤坏死因子a呈剂量依赖性抑制人冠状动脉内皮细胞的增殖。Hoechst 33258/PI染色观察可见凋亡细胞染色质凝集、细胞核碎裂成碎片等典型细胞凋亡的特征性变化,不同质量浓度肿瘤坏死因子a组细胞凋亡率高于对照组(P < 0.05),线粒体膜电位低于对照组(P < 0.05),且呈剂量依赖性。表明肿瘤坏死因子a呈剂量依赖性促进人冠状动脉内皮细胞凋亡,抑制其增殖,作用机制与线粒体凋亡通路有关。     

蜂胶抑制白血病K562细胞增殖机制的初步研究

目的: 探讨蜂胶对K562细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法: 体外培养K562细胞,将不同浓度的蜂胶掺入细胞,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,RT-PCR检测细胞中Nup98 mRNA表达水平。Western blotting检测细胞中Nup98蛋白表达水平。结果: 2 mg/L、20 mg/L和200 mg/L组蜂胶K562细胞的增殖抑制率和凋亡率明显高于对照组,并具有一定的时间和剂量依赖性。高浓度蜂胶作用后,Nup98 mRNA及蛋白表达均明显低于对照组。结论: 蜂胶可抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与下调Nup98的表达有关。     

氧化低密度脂蛋白对人血管内皮细胞ECV-304促增殖及诱导凋亡的作用

目的:探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管内皮细胞损伤作用的多样性。方法: 通过细胞形态学、台盼蓝活细胞计数、细胞毒四唑盐(MTT)比色试验、乳酸脱氢酶(LDH)、流式细胞凋亡和细胞凋亡小分子量DNA片段凝胶电泳测定法, 观察(0.1、1、10、100、150和200)mg/L的ox-LDL的条件培养液对人血管脐静脉内皮细胞ECV-304的影响。结果:(0.1-10)mg/L的ox-LDL对ECV-304细胞具有促增殖作用, 而增加浓度达100mg/L及以上时, 其表现则主要是对ECV-304的细胞毒性;而且, 这种细胞毒性以当ox-LDL的浓度达到150和200mg/L时, 在12h开始诱导ECV-304细胞出现凋亡, 分别达15.86%和21.89%。而当ox-LDL作用ECV-304细胞18h后, 则出现伴随凋亡的细胞坏死。结论:ox-LDL具有很强的细胞毒性, 其对内皮细胞的细胞毒性经历了促细胞增殖、凋亡前期、细胞凋亡和凋亡后的坏死等过程。     

当归枸杞制剂诱导脐血单个核细胞分化为肝细胞后人白蛋白的表达

背景：部分中药能够促进造血干细胞的生长及分化。 目的：观察当归、枸杞制剂促进人脐血单个核细胞生长分化为肝细胞的作用、作用条件及对肝衰竭的治疗效果。 方法：分离人脐血单个核细胞,加入不同剂量的当归及枸杞制剂,比较不同剂量当归及枸杞制剂对脐血单个核细胞及其转化为肝细胞后人白蛋白mRNA及人甲胎蛋白mRNA表达的影响。腹腔内注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝衰竭模型,随机分为生理盐水对照组、脐血单个核细胞组、脐血单个核细胞与当归、枸杞制剂灌胃和腹腔内注射免疫抑制剂不同组合8组,检测大鼠肝功能变化。 结果与结论：90 mg/L当归、40 mg/L枸杞制剂可促进单个核细胞的增殖和分化,并加快脐血单个核细胞分化为肝细胞,两者联合无药物协同作用。单独应用当归与枸杞对大鼠肝损伤均有一定的修复作用,与单个核细胞联合均可促进单个核细胞向肝细胞分化,增强修复肝损伤的作用,并且当归的修复效果优于枸杞。加用环磷酰胺后并不能增强当归或枸杞联合单个核细胞的治疗效果。     

蜂胶水提液对体外培养的血管内皮细胞凋亡的影响

目的：探讨泰山蜂胶水提液对一定浓度的肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用。方法:用消化灌注法收集人脐静脉内皮细胞进行体外原代培养，用终浓度为50 μg/L的肿瘤坏死因子-α诱导其凋亡，培养液中分别加入终浓度为50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的蜂胶水提液干预，共同孵育24h，用流式细胞仪和缺口末端标记技术TUNEL检测细胞凋亡率。结果:模型组内皮细胞凋亡率均明显高于对照组，不同浓度蜂胶组内皮细胞凋亡率明显低于模型组（P＜0.01）。结论:泰山蜂胶水提液能抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡，从而起到保护血管内皮细胞的作用。     

Inability of cyclophosphamide-induced tolerance to permit engraftment of pluripotent stem cells contained in a moderate number of syngeneic bone marrow cells

We have previously described cyclophosphamide (CP)-induced tolerance that comprises an intravenous (i.v.) injection of 1 x 10(8) allogeneic spleen cells (SC) followed, 2 days later, by an intraperitoneal (i.p.) administration of 200 mg/kg of CP. By using this method, we were able to readily induce both long-lasting mixed chimerism and skin allograft tolerance in most of H-2 matched combinations, but not in H-2 mismatched combinations. In the present study, we have investigated whether the treatment with SC followed by 200 mg/kg CP can permit engraftment of syngeneic pluripotent hematopoietic stem cells (HSC), and whether CP itself can permit the HSC engraftment. Recipient B6 (H-2b; Ly-5.2) mice received 1 x 10(7), 5 x 10(7) or 1 x 10(8) SC from syngeneic B6.Ly-5.1 (H-2b; Ly-5.1) mice and administered 2 day later 200 mg/kg CP. Using anti-Ly-5.1 and Ly-5.2 mAbs and a flow cytometry, the origins of lymphoid and myeloid cells injecting the recipients were observed over time. Chimerism was at least initially detectable in all groups treated with SC alone (without 200 mg/kg CP), but became undetectable by 32 weeks after the treatment with SC alone. In recipient B6 mice treated with B6.Ly-5.1 SC and 200 mg/kg CP, on the other hand, lymphoid-chimerism was detectable at 32 weeks in a transferred cell dose-dependent manner, but granulocyte-chimerism indicating pluripotent HSC engraftment disappeared earlier than 32 weeks after the treatment. In order to further evaluate the effect of CP itself on HSC engraftment, recipient B6 mice were given various doses of CP (50-400 mg/kg) and were injected with T cell-depleted 1 x 10(7) BMC from B6.Ly-5.1 mice. Multilineage mixed chimerism over 32 weeks was induced in only one of 11 B6 mice treated with 400 mg/kg CP followed by B6.Ly-5.1 BMC, although lymphoid chimerism was induced temporarily in recipient B6 mice treated with 200 mg/kg CP followed by B6.Ly-5.1 BMC and persistently in most of recipient B6 mice treated with 400 mg/kg CP followed by B6.Ly-5.1 BMC.     

肝星状细胞增殖与p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的关系

背景：肝星状细胞的激活、增殖导致肝纤维化,p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路可参与调控细胞增殖。 目的：探讨SB203580作用于乙醛刺激的大鼠肝星状细胞后p38丝裂原活化蛋白激酶活性变化和细胞增殖变化。 方法：体外培养大鼠肝星状细胞株,在乙醛干预的基础上加入不同浓度的p38特异性抑制剂SB203580进行培养,并设置对照。以Western blot检测磷酸化p38 蛋白表达水平变化,MTT比色法检测细胞增殖。 结果与结论：乙醛刺激后大鼠肝星状细胞内磷酸化p38水平增强,细胞增殖明显。使用5,10,20 μmol/L SB203580能明显抑制乙醛刺激的肝星状细胞增殖(P < 0.05),加大浓度至30 μmol/L时,抑制作用更明显(P < 0.01),抑制率为43.9%,而磷酸化p38水平也降低(P < 0.05)。结果证实,抑制p38丝裂原活化蛋白激酶活性可能影响肝星状细胞的增殖。     

薯蓣皂苷元在口腔鳞癌中的抗癌作用研究

目的 探究薯蓣皂苷元对口腔鳞癌 HSC4 细胞生物学行为的影响。 方法 将 HSC4 细胞分为薯蓣 皂苷元 0、 0. 5、 1、 2 μmol / L 4 组, CCK-8、 5-溴-2′-脱氧尿苷 (BrdU) 染色、 克隆形成实验、 流式细胞术、 划痕实验和 Transwell 实验分别检测细胞增殖、 凋亡、 迁移和侵袭, 免疫印迹检测 Bcl-2、 Bax 和 cleaced caspase-3 蛋白表达水平; JC-1 检测线粒体膜电位; H2DCFDA 检测活性氧 (ROS) 产生; 试剂盒检测谷胱 甘肽 (GSH) 和丙二醛 (MDA) 水平。 结果 与薯蓣皂苷元 0 μmol / L 组比较, 薯蓣皂苷元 1 μmol / L 组和 2 μmol / L 组细胞活力、 集落形成能力、 BrdU 阳性细胞率、 迁移和侵袭能力、 线粒体膜电位降低, 细胞凋亡 率升高, Bax 和 cleaced caspase-3 蛋白表达上调, Bcl-2 蛋白表达下调, ROS 和 MDA 水平升高, GSH 水平降 低。 结论 薯蓣皂苷元可抑制 HSC4 细胞的增殖和运动能力, 通过线粒体途径和 ROS 的产生诱导细胞凋亡。     

体外研究抗CD20单克隆抗体对骨髓瘤细胞的细胞毒性作用

目的:体外探讨上调多发性骨髓瘤(MM)细胞表面CD20抗原表达后,抗CD20单克隆抗体美罗华对骨髓瘤细胞的细胞毒性作用。方法:将浓度为(0-800)×10³U/L的重组人干扰素γ(hrγ-IFN),分别与10例初治(初治组)和10例复发难治(难治组)的MM患者瘤细胞共同培养,流式细胞仪测定培养前后瘤细胞表面CD20的表达;应用MTT比色法分析不同浓度美罗华对CD20抗原表达上调后瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)。结果:hrγ-IFN浓度分别≥5×10⁴U/L或≥1×10⁵U/L,可明显增加初治组或难治组瘤细胞表面CD20的表达,在用8×10⁵U/Lhrγ-IFN上调瘤细胞表面CD20抗原的表达后,12mg/L和16mg/L的美罗华分别能显著介导初治组和难治组效应细胞对MM瘤细胞的ADCC和激活CDC。结论:体外hrγ-IFN上调MM瘤细胞表面CD20的表达后、抗CD20单克隆抗体美罗华具有对瘤细胞的ADCC和CDC效应。     

连接蛋白/缝隙连接细胞间通讯对大鼠肝卵圆细胞增殖调控作用

背景：缝隙连接蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)是细胞间最重要的信息交流形式。 目的：验证CX/GJIC对卵圆细胞的增殖调控作用。 方法：Wistar大鼠分为4组。对照组正常饮食;2-AAF/PH组按改良Solt-Farber法建立卵圆细胞增殖动物模型;苯巴比妥组予以苯巴比妥饮水7 d,第8天按2-AAF/PH组建模,苯巴比妥饮水持续至实验结束;三七总皂苷组按2-AAF/PH组建模时予以三七总皂苷25 mg/(kg•d)腹腔内注射,并持续实验结束。 结果与结论：造模后肝脏连接蛋白呈时空特异性表达,先下调后逐渐恢复,连接蛋白43表达于卵圆细胞,先升高后逐渐恢复;采用苯巴比妥改变大鼠2-AAF/PH模型肝脏的连接蛋白32、连接蛋白43时空表达模式后,可下调肝脏的GJIC,减少卵圆细胞与偶联细胞间GJIC,解除卵圆细胞生长抑制,促进卵圆细胞的增殖;三七总皂苷可以增加大鼠2-AAF/PH模型肝脏的连接蛋白32表达、滞后连接蛋白43的表达,增加卵圆细胞与偶联细胞间GJIC,使卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长;通过下调大鼠2-AAF/PH模型肝脏的GJIC,可使卵圆细胞增殖早、增殖水平高;上调GJIC使卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长,CX/GJIC可以调节体内卵圆细胞的增殖、分化过程。