小鼠DEAF1多克隆抗体的制备及应用

为研究DEAF1在小鼠胰淋巴结中的内源性表达及调控外周组织抗原基因表达的机制,将DEAF1的原核表达质粒转化至E.coli BL21中,诱导获得重组DEAF1蛋白;经尿素梯度裂解包涵体纯化获得的重组DEAF1蛋白分期免疫Balb/C小鼠,获取鼠抗DEAF1的多克隆抗血清;采用ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫沉淀分别鉴定其效价、特异性、敏感性和亲和力。结果表明,抗血清可与抗原发生特异性的免疫反应,可用于检测DEAF1的表达及荧光定位,抗血清与抗原有较高的亲和力。结果证明所制备的多克隆抗血清具有较高的特异性、敏感性和亲和力。     

棉铃虫Hsp70的多克隆抗体制备及鉴定

HSPs(热休克蛋白)是机体在不利环境条件刺激下合成的一类蛋白质,在进化上高度保守,普遍存在于生物体,其中Hsp70是最为保守的成员。研究发现,昆虫滞育过程中普遍存在Hsp70表达上调的现象。然而,现有的研究均是在基因水平的检测结果。为了能从蛋白水平检测棉铃虫中Hsp70的表达,本研究制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。构建了hsp70的原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔子,制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。抗体的效价较高,达到了1∶256 000,此外Western结果表明,制备的抗体能检测出热诱导的Hsp70蛋白。本研究制备了高效价且较为特异的Hsp70对克隆抗体,该抗体为后续从蛋白水平研究棉铃虫滞育过程中Hsp70的表达及其分子机制奠定了基础。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

棉铃虫β-catenin的多克隆抗体制备及在蛹脑中的表达研究

β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究构建β-catenin的原核表达载体,成功地在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达。镍柱纯化重组蛋白后免疫兔子,制备了抗棉铃虫β-catenin的多克隆抗体。ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性,结果表明抗体的效价较高,特异性较好。最后应用该抗体调查了滞育和发育蛹脑中β-catenin的表达情况,从蛋白水平证实了发育蛹脑中β-catenin高于滞育蛹脑。本研究为后续研究棉铃虫β-catenin的功能以及Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

小麦TaMAPK2激酶基因的原核表达以及多克隆抗体制备

MAPK蛋白激酶是一类重要的植物胁迫信号调控因子.为了研究小麦MAPK基因的功能,苯试验克隆了小麦MAPK蛋白激酶基因TaMAPK2.为了制备TaMAPK2基因的多克隆抗体,TaMAPK2的非保守区段的DNA序列anti-MAPK2被构建到原核表达载体 pET-28a-(+)上,表达融合蛋白His-antiMAPK2.在终浓度为1 mmol/L IPTG诱导1h的条件下,融合蛋白His-antiMAPK2表达量达到最大.通过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)得到纯化的His-antiMAPK2融合蛋白.利用新西兰大白兔制备了TaMAPK2基因的多克隆抗体,ELISA竞争抑制法检测抗体效价检测,效价为1:80000,能满足后续试验要求的效价值,为进一步分析TaMAPK2的蛋白定位、表达等提供基础.     

青杄FKBP12基因原核表达和多克隆抗体的制备

目的:制备青杄FKBP12基因的多克隆抗体,为进一步分析FKBP12的蛋白定位、表达等提供基础。方法:采用PCR方法扩增FKBP12基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,转化入BL21菌株。经IPTG诱导,表达了分子量约为33kD的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。此蛋白经亲和纯化后,作为抗原注射新西兰兔,进行抗体制备。结果:成功获取了多克隆抗体,制备的FKBP12兔抗血清效价在1∶729 000以上,ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP蛋白兔多克隆抗体效价高,检测灵敏度为16ng/mL。结论:所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值,为进一步研究提供基础。     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。     

人接头蛋白NRBP的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:制备接头蛋白NRBP的兔多克隆抗体,并检测该抗体的效价及特异性。方法:PCR方法以重组质粒PEF-NRBP为模板,获得NRBP全长及NRBP(1-99Aa)cDNA,构建到原核表达质粒pET-21a及pGEX-6P-1中。分别转入大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导表达后,纯化并鉴定表达产物将其免疫家兔,间接ELISA法及免疫印迹等方法鉴定抗体。结果:成功获得人NRBP的cDNA,构建得到相关的原核表达质粒,在大肠杆菌中可诱导性高表达,纯化后蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经ELISA检测为阳性结果,4只免疫家兔的抗体效价约为1:5 200～1:40 000。Western印迹结果显示,该抗体可特异性的识别真核细胞外源性及内源性约60kDa的NRBP蛋白,并且具有较强免疫沉淀能力。结论:NRBP多克隆抗体具有很好的特异性和敏感性,该抗体的成功制备为进一步研究NRBP的功能提供了重要工具。     

小麦类脱水素的表达、纯化及多克隆抗体的制备

脱水素在胚胎发育后期累积,外源脱落酸(ABA)、低温、干旱和其他一些环境条件下能诱导脱水素的产生,尽管植物在脱水条件下脱水素广泛存在于细胞中,但其生化功能仍不清楚.为研究小麦在不同时期脱水素基因的表达情况和生物学功能及抗体制备,以小麦幼芽为材料,经干旱胁迫处理后,提取总RNA,通过RT-PCR得到小麦类脱水素基因片段(WZY1-1),再连接至克隆载体PUCM-T,并成功构建重组表达质粒PET-32a( )-wzy1-1,将阳性重组质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.结果表明,表达蛋白位于37ku处,小麦类脱水素基因获得高效表达.表达蛋白经Ni2 琼脂糖凝胶亲和层析和透析袋电洗脱法纯化后,对兔子进行免疫,制备的抗血清通过ELISA检测到较高的多克隆抗体效价.蛋白质印迹结果显示,利用纯化的蛋白质制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白质带特异性结合,且郑引1号小麦幼苗进行干旱处理,提取粗蛋白,SDS-PAGE,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28ku处出现特异的蛋白质条带,这说明所制备的抗血清可以与小麦叶片所表达的dehydrin蛋白特异性结合,证明其具有良好的免疫原性.     

兔抗仿蜘蛛牵丝蛋白抗体的制备及应用

将仿蜘蛛牵丝基因s6 0 0克隆到GST融合蛋白表达质粒pGEX KG中 ,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了仿蜘蛛牵丝蛋白S6 0 0 ,以之作为抗原制备了兔抗血清。S6 0 0的氨基酸组分分析与理论值相吻合。蛋白质免疫印迹发现该抗血清能与天然蜘蛛丝反应 ,表明设计的仿蜘蛛丝与天然蜘蛛丝有相似的免疫原性。为了定量检测仿蜘蛛牵丝蛋白在转基因家蚕丝腺中 (或茧壳中 )的表达 ,建立了用ELISA方法定量检测茧壳中仿蜘蛛牵丝蛋白量的工作系统     

除草剂2,4-D特异性多克隆抗体的制备及鉴定

目的是制备特异性的2,4-D多克隆抗体.用活性酯和混合酸酐法将半抗原2,4-D分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联;以2,4-D-BSA作免疫原免疫两只新西兰白兔;以2,4-D-OVA包被96孔酶标板,用间接酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测抗血清效价和竞争性ELISA法检测2,4-D.结果显示2,4-D与BSA和OVA的偶联比率分别为32∶1和18∶1,抗血清效价＞6.4×105,在优化条件下2,4-D的最低检测限达37ng/mL.实验成功地制备了2,4-D特异性多克隆抗体,为其ELISA方法的建立提供了条件.     

跨膜逆向转运蛋白NHXFS1多克隆抗体的制备及应用

NHXFS1基因是通过DNA家族改组（DNA family shuffling）技术,以拟南芥、水稻和菊花的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因（NHX1）为亲本获得的活性显著增强的新基因。为制备该蛋白的多克隆抗体,对该蛋白进行跨膜结构分析,选取跨膜蛋白的C末端为靶标,并将其克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建了原核融合蛋白pET32a-NHXFS1-抗原表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。通过镍柱亲和层析纯化该融合表达蛋白,获得了纯度约为80%的纯化蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA实验表明,该抗体的效价达到1：128 000,提取表达NHXFS1蛋白的酵母液泡经该多克隆抗体Western blot检测,证明该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。NHXFS1多克隆抗体的制备为进一步认识NHXFS1新蛋白结构与功能以及植物耐盐分子生物学的研究奠定了基础。     

Polyclonal Antibody Production in Murine Spleen Cells Induced by Staphylococcus

Polyclonal plaque-forming cell (PFC) responses in murine spleen cells induced by Staphylococcus aureus and S. epidermidis were studied. Injection of Balb/c mice with S. aureus strain 248βH resulted in the generation of anti-trinitrophenyl (TNP) and anti-sheep red blood cell PFC in their spleens. Cultures of Balb/c spleen cells in the presence of S. aureus 248βH, Cowan I, or a protein A-deficient mutant yielded many anti-TNP PFC. The larger the number of organisms that were added to the cultures, the better was the PFC response. Both living and killed organisms, were capable of inducing the response, but an excess of living 248βH organisms in the cultures abrogated the response. All of the organisms (12 strains of S. aureus and 11 strains of S. epidermidis) freshly isolated from patients had the ability to induce the polyclonal PFC response in cell cultures. These organisms stimulated cultured C3H/HeJ mouse spleen cells, which were unresponsive to bacterial lipopolysaccharide (LPS). Cultured cells from the spleens of athymic nu/nu mice also responded to these organisms, and the number of PFC in nu/nu cell cultures was always greater than that in nu/+ cells prepared from a haired litter mate. Moreover, the responses of nu/nu spleen cell cultures to which nylon wool column-filtered splenic nu/+ T cells were added were lower than expected. These findings suggest that the polyclonal PFC response to staphylococci is thymus independent, but that the magnitude of the response is regulated by mature T cells. Cultures of macrophage-depleted spleen cells responded to the organisms to an extent similar to that of the control. The 248βH organisms were less capable of stimulating spleen cells of 2-week-old mice (i.e., early maturing B cells) than LPS. However, spleen cells from adult (7-week-old) and aged (9-month-old) mice responded well to both the organisms and LPS. Previous sensitization with the organisms in vivo did not affect any polyclonal responses of spleen cells in vitro to either the organisms or LPS. The role of staphylococcal protein A in the polyclonal PFC response to staphylococci is discussed.     

人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

目的：表达、纯化带GST标签的DNA裂解因子45（DNA fragmentation factor 45 ,DFF45）融合蛋白并制备多克隆抗体。方法：构建pGEX-5X-1/DFF45原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr-activated Sepharose? 4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,同时用免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察DFF45的细胞定位。进一步检测DFF45在人类几种细胞系的表达差异情况。结果：成功构建原核表达质粒,表达、纯化DFF45蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1:20 000,Western blot确定抗体具有高度特异性。应用该抗体检测发现DFF45在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论：DFF45多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达,为进一步研究DFF45基因与肿瘤及其相关疾病的关系奠定了基础。     

NPR1多肽抗体的制备和应用

根据NCBI GenBank中报道的NPR1一级结构信息,采用Blastn、Blastx、ExPASy和Protean等软件进行序列同源性和抗原性指数分析,获得三段序列特异性较高的多肽,并从中优选一段序列特异性多肽,采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽,采用HPLC和LC-MS测定合成多肽的浓度和分子量,试验表明目的多肽纯度达88%、目的多肽分子量为1.92234 kD。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH进行偶联获得免疫原Pep-KLH,并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体,采用ELISA和Western blotting测定其效价和特异性,经ELISA检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep发生特异性免疫反应,经Western blotting试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带,其相对分子量为65 kD,与预测分子量相符,表明利用该方法制备的NPR1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。     

Production of Polyclonal Antibody to the Bovine Adrenal Atrial Natriuretic Factor-R1 Receptor

Abstract

A polyclonal antibody monospecific for an intracellular epitope of the atrial natriuretic factor (ANF)-R₁ receptor was produced. The receptor protein (200 pmoles) was purified to homogeneity from bovine adrenal zona glomerulosa (BAZG), reduced, alkylated and digested with trypsin. The tryptic fragments were purified by reverse-phase h.p.l.c. on a C18 column. Based on the sequence of one of these fragments, a peptide was chemically synthesized, coupled to thyroglobulin and injected into rabbits. The antibody obtained was shown to be specific for the R₁-type as no receptor was detected in bovine red blood cells (RBC) (which are devoid of ANF receptors) and in NIH-3T3 cell membranes (where only the R₂-type is expressed). Several other tissues were screened and comparison of the immunoreactive receptor density estimates with those obtained by ANF binding yielded a correlation coefficient (r²) of 0.965. The minimal detectable dose was typically 3 fmoles/tube and the ED⁵⁰ of the RIA was 30 fmoles/tube. Cyanogen bromide digestion of the receptor was essential for antigenic detection, indicating that the epitope is probably hindered due to the tertiary structure of the native protein. Moreover, location of the epitope in the kinase homology domain of the receptor, combined with partial tryptic digestion, suggests that the proteolysis-sensitive region of the receptor is located between the transmembrane- spanning domain and the amino acid 586. This method of production of antibodies should be useful to precisely map the amino acids involved in various functions of the receptor.     

莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体制备及应用

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究。方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,成功构建p ET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Western blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性。结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础。     

抗谷胱甘肽S转移酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的:制备谷胱甘肽S转移酶(GST)的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法:用纯化的GST标签蛋白(纯度>98%)免疫新西兰大白兔,获得GST的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性,并与商业化抗体进行对比。结果:通过免疫法得到了GST的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1∶1×106,经rProtein A柱纯化后获得了高效价高特异性的抗体,其高效高特异性已达商业化抗体水平。结论:获得了GST的高效价高特异性的兔多克隆抗体。