猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白表达及活性检测

依据猫IFN-ω3和THY-α1的分子结构特征及大肠杆菌密码子的偏爱性设计引物,同时在IFN-ω3和THY-α1中间设计了1个(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)×3总共15肽的linker.采用搭桥PCR方法获得二者的融合基因.将该基因克隆至pBVIL载体中,构建了pBVIL-IFNω3-THYα1原核表达载体.将重组栽体转化至Rosseta(DE3)细胞中,经过IPTG诱导表达及蛋白质分离纯化,获得了质量浓度为0.78 g/L的IFNω3-THYα1融合蛋白.经E玫瑰花环形成试验和细胞病变抑制试验,结果表明E玫瑰花环形成率平均为23.4%,融合蛋白的活力值为7.4%,细胞病变抑制试验同阳性对照组结果基本一致,融合蛋白中的IFNω3、THYα1均较好地保持各自的生物活性,为IFNω3-THYα1融合蛋白进一步的开发和应用奠定了基础.     

鸡SUMO1的HIS/GST双融合纯化标签载体的构建及表达分析

SUMO(small ubiquitin-related modifier,小泛素样相关修饰物)是一种重要的蛋白翻译后修饰物,对调节蛋白质的活性、功能和细胞定位都起着至关重要的作用。虽然SUMO和泛素的空间结构很相似,但是发挥的功能却有很大的不同,SUMO不像泛素那样介导蛋白质的降解,反而可以增强蛋白质的稳定性。近年来,研究发现人的SUMO作为一种融合标签和分子伴侣来可以显著增加一些难溶解蛋白的可溶性表达。本研究以原核表达载体pET-28a为基础构建了鸡SUMO1重组质粒HIS-SUMO1-GST-pET28a,并在SUMO1和GST之间插入IL2得到重组质粒HIS-SUMO1-IL2-GST-pET28a,经IPTG诱导表达,并分别使用Ni-NTA及Glutathione-sepharose 2次亲和层析纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。活性分析发现去SUMO化酶人的SENP1可完全切开纯化融合的蛋白经。结果表明,此SUMO融合的HIS/GST双标签表达载体不但可以用于提高难溶蛋白的溶解度,而且表达产物也作为去SUMO化酶研究的底物。     

PADRE-TGFβ1融合蛋白的原核表达及鉴定

构建PADRE-TGFβ1原核表达质粒,并对其进行诱导表达和反应原性分析.对PADRE、联接序列(Linker)及TGFβ1的基因序列进行密码子优化,采用全基因合成的方法人工合成全长PADRE-Linker-TGFβ1序列,合成产物克隆至pET-28a(+)质粒.将构建好的质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受...     

犬干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

依据IFNα1和THYα1的分子结构特征设计了1个连接肽,根据氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,采用PCR方法合成了三者融合基因,将该基因克隆至pGEX4T-2载体中,构建了pGEX4T-2-IFNα1-THYα1原核表达质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)受体菌中,37℃培养至D600为0.6~1.0时,IPTG(1.0 mmol/L)诱导培养4 h,经SDS-PEGA和Western-blot鉴定,目的蛋白获得高效表达。     

ST_1肠毒素基因的合成、克隆及其融合蛋白的高效表达

用ＤＮＡ合成仪合成了编码ＳＴ１肠毒素第５８到７２位氨基酸残基的ＤＮＡ片段,并将其与表达融合蛋白的载体ＰＧＥＭＥＸ－１重组,转化受体菌ＪＭ１０９（ＤＥ－３）。筛选出的重组克隆经过１ＰＴＧ４小时诱导,ＳＴ１融合蛋白的产量超过超过细菌蛋白总量的４０％,最高达５９．９％。     

高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis) A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子P_eno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP) gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-P_eno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-P_eno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中P_eno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子P_eno、GFP及PBP1b (GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD_600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western bl...     

鸡β-防御素-1基因(Gal-1)在大肠杆菌中的融合表达与纯化

内源性抗菌多肽防御素是机体先天性免疫系统的重要组成部分，可帮助机体防御外界病原微生物的入侵。鸡β防御素-1（Gallinaein-1，Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用，具有很好的研究开发价值。本研究利用PCR技术从重组质粒pGEM-TEasy-gal-1中克隆出Gal-1基因成熟肽区，将该基因插入原核表达载体pET-32a（＋）中，构建重组质粒pET-32a（＋）-gal-1，然后用重组质粒转化大肠杆菌BL-21。挑选阳性克隆菌，用浓度为0．5mmol／L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳显示在目标位置约25kD处出现了条带并用Werstern Blot进行了鉴定。表明Gal-1基因在大肠杆菌以融合形式得到了表达。经灰度扫描显示重组蛋白表达量占细菌总蛋白的15．54％。用50％Ni-NTA纯化树脂进行层析纯化，在洗脱液E中出现单一条带。Gal-1多肽在pET-32a（＋）质粒表达体系中成功表达为鸡防御素多肽下一步的研究奠定基础。     

杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及免疫原性评估

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,能诱导宿主产生特异性免疫应答。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。利用杆状病毒表面展示系统,将这2种病毒蛋白与猪CD40配体(CD40 ligand,CD40L)进行融合表达并展示在杆状病毒表面,构建了rv Ac-Cap、rv Ac-VP1和rv Ac-Cap-VP1 3种重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blotting检测3种重组杆状病毒感染的Sf9细胞总蛋白,证明3种融合蛋白成功表达。纯化的重组杆状病毒颗粒以1×108pfu/只的剂量免疫接种BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测血清中Cap和VP1的抗体浓度,证明表面展示有Cap和VP1的重组杆状病毒能激发小鼠产生较高水平的抗体,与PCV2和FMDV商品化疫苗免疫组的抗体浓度差异不显著(P0.05),表明该重组杆状病毒具有较好的免疫原性。     

含不同个数基序肽聚糖锚钩蛋白与纳米抗体融合表达对GEM颗粒结合活性的比较

比较3种含不同个数基序肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor,PA)的结合活性。首先应用PCR技术分别扩增得到含有1个、2个和3个自溶素基序(Lysin Motif,Lys M)基因片段的PA、PA2与PA3;然后应用含纳米抗体(nanobody,Nb)基因的重组质粒p ET-28a(+)-Nb构建原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL-21(DE3),进行诱导表达,获得目的蛋白;最后将可溶性的PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb融合蛋白与GEM(Gram-positive enhancer matrix)颗粒结合,经Western blot与SDS-PAGE进行结合鉴定与结合活性比较分析。试验结果显示裂解后可溶性的融合蛋白PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb都能与GEM颗粒结合,PA2-Nb与GEM颗粒的结合活性明显好于PA-Nb,PA2-Nb的表达量和可溶性明显优于PA3-Nb,PA2-Nb与GEM颗粒的结合活性与PA3-Nb相当。本研究可为进一步完善乳球菌外壳-蛋白锚钩展示系统提供理论依据。     

家蚕G蛋白γ1亚基(BmGγ1)的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制,运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基(Gγ1)的序列,设计引物验证预测序列后,克隆了家蚕Gγ1的序列,再通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+)后,导入E.coliBL21宿主菌中,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferase,GST)融合蛋白,并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因,并在E.coliBL21中高效表达。