PMA-LAMP检测单增李斯特活菌方法的建立

建立一种将荧光染料Propidium Monoazide(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的检测方法,用于高效检测活的单核细胞增多性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)。利用PMA抑制单增李斯特死菌后进行LAMP扩增实验、并研究了PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的灵敏度,同时与PMA-PCR方法灵敏度进行比较。结果表明,50μmol/L的PMA处理浓度为5×108cfu/mL单增李斯特死菌,能够完全抑制LAMP扩增。PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的检出限为4.9×101cfu/mL,其灵敏度是PMA-PCR方法的10倍。该方法可以作为一种快速检测单增李斯特活菌的新技术。     

单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立

建立一种可快速检测单增李斯特菌的反转录-环介导等温扩增方法。针对单增李斯特菌的李氏溶血素基因(hly)设计多组引物,经引物筛选和配比优化,建立检测单增李斯特菌的实时荧光RT-LAMP方法,并通过菌株特异性、灵敏度和人工污染脱脂乳样品中的检出限对该方法进行评价。该方法特异性良好, 26株菌株中仅三株单增李斯特菌检出阳性;检测灵敏度高,对单增李斯特菌的菌悬液灵敏度为10~1 CFU/mL,是RT-qPCR方法检测灵敏度的10倍。人工污染样品直接检测的检出限为10~3 CFU/mL,而对样品增菌16 h后,单增李斯特菌的检出限提高到10~0 CFU/25 mL。所建立的RT-LAMP方法可以快速、准确地检测单增李斯特菌,操作简便,适合应急和现场监测使用。     

环介导等温扩增技术快速检测食品中的单增李斯特氏菌

采用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测食品中的单增李斯特氏菌,并做特异性、敏感性和适用性试验。试验结果显示以单增李斯特氏菌hly基因保守区设计特异性引物,进行DNA等温扩增是可行的。3株单增李斯特氏菌均扩增出特异性目的片段,而10株非单增李斯特氏菌均未产生目的片段。用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达100cfu/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测50种样品中的单增李斯特氏菌,结果数据显示两种方法的符合率达100%,表明环介导等温扩增法具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌

该研究针对单增李斯特氏菌的特异性基因hlyA设计引物,优化反应条件,建立实时荧光环介导等温扩增（realtime loop-mediated isothermal amplification,real-time LAMP）的检测方法,在此基础上,建立检测单增李斯特氏菌的基于淬灭基团释放环介导等温扩增检测方法（detection of amplification by release of quenching-LAMP,DARQ-LAMP）,分析其特异性和灵敏度。结果表明,该方法的适宜反应条件为反应温度63℃、Bst DNA 3.0聚合酶0.32 U/μL、淬灭探针双链（quenching probe double chain,QPD）探针浓度10%、Mg2+浓度6 mmol/L;对单增李斯特菌的检测限为7.3×101copies/mL,灵敏度是普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的100倍。该方法效率高、特异性好、灵敏度高,为环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究提供参考。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测熏肉中单增李斯特氏菌的研究

建立一种实时荧光环介导等温扩增方法(Real-Time Fluorescence Loop-mediated Isothermal Amplification,RTF-LAMP)来快速、灵敏地检测熏肉中单增李斯特氏菌。针对单增李斯特氏菌的特异性基因inl B设计4条LAMP引物,并建立一套最优的RTF-LAMP反应体系。对该方法进行特异性验证,同时对灵敏度和人工污染熏肉的检出限进行测定。3株单增李斯特氏菌被检测为阳性,17株非单增李斯特氏菌为阴性。表明引物具有良好的特异性。RTF-LAMP和传统LAMP检测单增李斯特氏菌的灵敏度分别为1.1×10~1、1.1×10~2 CFU/m L。通过对熏肉进行人工污染,得出RTF-LAMP的检出限为3.5×10~1 CFU/g。通过与国标方法GB 4789.30—2016进行对比并计算RTF-LAMP反应的敏感性,特异性和准确度,结果分别为100.00%、98.44%和98.46%。研究建立的RTF-LAMP能够实时、快速地检测熏肉中单增李斯特氏菌,具有良好的应用前景。     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

改良LAMP检测鸡肉中单增李斯特氏菌的研究

本研究建立一种改良环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测鸡肉中单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L. monocytogenes)的方法。针对单增李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)设计LAMP引物,对单增李斯特氏菌进行特异性检测,通过荧光曲线和肉眼观察荧光颜色来判定检测结果。试验结果表明:改良LAMP方法检测单增李斯特氏菌具有良好的特异性,7株单增李斯特氏菌呈阳性结果,24株非单增李斯特氏菌呈阴性结果。与聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法相比,改良LAMP方法具有灵敏度高(5.4×100 fg/μL)、检出限低(3.9×100 CFU/g)的特点,均是PCR结果的100倍。对66份鸡肉样品进行检测,得到改良LAMP方法的敏感性为100%,特异性为98.41%,符合率为98.48%。综上所述,改良LAMP方法能够快速、准确的检测单增李斯特氏菌,具有很好的应用前景。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌

通过建立的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法以达到肉中单增李斯特菌快速、灵敏的检出。以特异性的hly A毒力基因作为靶基因,与6株非单增李斯特菌进行特异性试验,同时对不同培养浓度的单增李斯特菌进行了LAMP和PCR方法的灵敏度比较,进而应用LAMP法检测人工污染肉中的单增李斯特菌。结果表明:纯培养物中单增李斯特菌LAMP检出限为8.8×10~0CFU/m L,其灵敏度比普通PCR高100倍;在人工污染肉中单增李斯特菌的检出限为8.8×10~1CFU/m L,在1h内即可完成扩增反应。LAMP方法具备快速、特异、简单、灵敏度高等优势,在食品基质中单增李斯特菌的检测方面具有较好的应用前景。     

EMA-LAMP方法快速鉴别检测单增李斯特菌

作者建立一种将叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)结合环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的新分析方法(EMA-LAMP),快速鉴别检测单增李斯特菌。通过对单增李斯特菌hly基因的六个区域设计4条LAMP特异性引物,EMA-LAMP在63℃下反应1 h,检测单增李斯特菌的死活细胞。结果表明,在浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特死菌悬液中,使EMA激活光解进入死细胞中且与DNA结合的最佳曝光时间至少为20 min,不抑制活菌细胞DNA的LAMP扩增的最大EMA质量浓度为10μg/mL,而抑制死菌细胞DNA的LAMP扩增的最小EMA质量浓度为4.0μg/mL;活菌细胞的检出限为20 CFU/mL。     

恒温实时荧光法快速检测不同样品中的单增李斯特菌

为实现乳制品中、临床病人腹泻物中单增李斯特菌的快速检测,选用外引物F3和B3、内引物FIP和BIP作为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,采用便携式荧光恒温扩增仪作为检测平台,选取单增李斯特菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定;选用人工污染的15份乳制品样品和20份腹泻样品进行适用性实验;以上样品同时利用国标法GB4789.30-2010进行菌落计数。结果表明:恒温实时荧光法对纯培养的单增李斯特菌基因组DNA、乳制品和腹泻样品中的单增李斯特菌基因组DNA灵敏度均达到10~2CFU/mL、检测限均达到10~3 CFU/mL;阴性样本出现假阳性的概率分别为0、0.03%和0;单增李斯特菌污染浓度在检出限以上的阳性样本检出率分别为100%、99%和92%。研究表明恒温实时荧光法的检测结果与传统国标培养结果基本一致,恒温实时荧光法适用于乳制品中和临床腹泻样本中单增李斯特菌的快速检测。     

褪黑素对小鼠抗氧化作用的影响

目的:研究小鼠在受到脂多糖(LPS)刺激时,褪黑素的抗氧化作用,并探讨其可能机制。方法:用脂多糖建立氧化应激模型,检测血清、小肠、肝脏和脾组织中的ROS含量,肝脏、脾组织中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的变化。结果:在LPS刺激后的4h和16h,褪黑素均能降低血清、小肠、肝脏、脾组织中的ROS含量,提升肝脏和脾组织中的GSH-PX、SOD活性,降低MDA含量。结论:褪黑素有助于增强氧化应激小鼠的抗氧化能力,降低组织中NO含量与NO合成酶活性,增加了SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性,保护机体免受氧化损伤。     

Determination of the variability of both hydrophilic and lipophilic toxins in endemic wild bivalves and carnivorous gastropods from the Southern part of Chile

The aim of this study was to analyse and determine the composition of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins and lipophilic toxins in the Region of Aysén, Chile, in wild endemic mussels (Mytilus chilensis, Venus antiqua, Aulacomya ater, Choromytilus chorus, Tagelus dombeii and Gari solida) and in two endemic carnivorous molluscs species (Concholepas concholepas and Argobuccinum ranelliforme). PSP-toxin contents were determined by using HPLC with fluorescence detection, while lipophilic toxins were determined by using LC-MS/MS. Mean concentrations for the total of PSP toxins were in the range 55–2505 μg saxitoxin-equivalent/100 g. The two most contaminated samples for PSP toxicity were bivalve Gari solida and carnivorous Argobuccinum ranelliforme with 2505 ± 101 and 1850 ± 137 μg saxitoxin-equivalent/100 g, respectively (p < 0.05). The lipophilic toxins identified were okadaic acid, dinophysistoxin-1 (DTX-1), azaspiracid-1 (AZA-1), pectenotoxin-2 (PTX-2) and yessotoxins (YTX). All analysed molluscs contained lipophilic toxins at levels ranging from 56 ± 4.8 to 156.1 ± 8.2 μg of okadaic acid-equivalent/kg shellfish together with YTX at levels ranging from 1.0 ± 0.1 to 18 ± 0.9 μg of YTX-equivalent/kg shellfish and AZA at levels ranging from 3.6 ± 0.2 to 31 ± 2.1 μg of AZA-equivalent/kg shellfish. Furthermore, different bivalves and gastropods differ in their capacity of retention of lipophilic toxins, as shown by the determination of their respective lipophilic toxins levels. In all the evaluated species, the presence of lipophilic toxins associated with biotransformation in molluscs and carnivorous gastropods was not identified, in contrast to the identification of PSP toxins, where the profiles identified in the different species are directly related to biotransformation processes. Thus, this study provides evidence that the concentration of toxins in the food intake of the evaluated species (Bivalvia and Gastropoda class) determines the degree of bioaccumulation and biotransformation they will thereafter exhibit.     

气相色谱法检测饮料中二羰基化合物

建立同时在线检测丙酮醛和乙二醛的气相色谱方法。确定检测二羰基化合物的最佳条件为：以丁二酮为内标,以邻苯二胺为衍生化试剂,邻苯二胺的用量67 倍于二羰基化合物、衍生化时间10 min、萃取溶剂二氯甲烷、超声时间15 min、萃取2 次、柱箱初始温度40 ℃、程序升温5 ℃/min,色谱柱载气流量2.0 mL/min,分流比1∶1。丙酮醛和乙二醛的定量限（RSN≈10）分别为0.06 mg/L和0.08 mg/L,检出限（RSN≈ 3）分别为0.02 mg/L和0.03 mg/L,方法灵敏度高。     

高效液相色谱法同时检测6种甜味剂

建立同时测定6种人工合成甜味剂阿斯巴甜、糖精钠、甜蜜素、安塞蜜、纽甜、甜聚糖甙的高效液相色谱分析方法。以Platicil ODS柱为分离柱,20mmol/L硫酸铵缓冲溶液(pH4.4)-乙腈为流动相,进行梯度洗脱。采用二极管阵列检测器进行检测,整个分离过程在30min内完成。6种甜味剂在0.4～120mg/L范围内其质量浓度与峰面积的线性关系良好,相关系数为0.99967～0.99998,在4.0～10.0mg/kg范围内,样品加标回收率为85%～107%;相对标准偏差小于3.2%。该方法简便、快速,净化效果较好,可用于食品中6种甜味剂的同时测定。     

亚甲基蓝对单增李斯特菌菌膜的光动力杀伤作用

探讨单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）生物菌膜的生长特性及亚甲基蓝对LM生物菌膜光动力杀伤作用。通过结晶紫染色法判断与观察LM生物菌膜的形成并用酶标仪在595 nm波长处对其不同生长阶段的生物量进行测定,同时通过细菌平板菌落计数法研究亚甲基蓝对LM生物菌膜的光动力杀伤作用。结果表明：结晶紫染色法可用于定性判断与观察LM生物菌膜,且随着培养时间的延长,LM生物菌膜生物量不断增加,形成的网状结构越来越致密。当光敏剂质量浓度为10 μg/mL的亚甲基蓝在光功密度为200 mW/cm2 的可见光照射30 min时,即可使LM生物菌膜的失活率达到99.99%以上,其菌落数降低了4.08（lg（CFU/mL））。亚甲基蓝对LM生物菌膜的光动力灭活作用非常显著,其杀伤效果主要取决于光敏剂质量浓度和光照时间。     

亚精胺对小鼠骨骼肌自由基代谢影响及抗疲劳的效果研究

目的：研究亚精胺（spermidine,SPD）对骨骼肌自由基代谢的影响以及抗疲劳作用。方法：实验分为生理盐水组、SPD低剂量组（0.5 mmol/（kg·d））、中剂量组（1.0 mmol/（kg·d））、高剂量组（1.5 mmol/（kg·d））以及西洋参口服液阳性对照组（总皂苷30 mg/（kg·d））,每周灌胃6 d共30 d,每次灌胃前称量小鼠体质量调整灌胃溶液量,灌胃期间进行每天45 min无负重游泳训练。各组随机选取10 只小鼠测试力竭游泳时间;各组剩余10 只负重游泳30 min,休息30 min后取材,检测血清肌酸激酶（creatine kinase,CK）、骨骼肌谷胱甘肽-过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase,T-SOD）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH）活性和骨骼肌丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。结果：与生理盐水组比较,SPD能显著延长小鼠力竭游泳时间（P＜0.05）;低、中剂量组骨骼肌中GSH-Px、T-SOD、SDH酶活性显著提高（P＜0.05）,MDA含量显著降低（P＜0.05）;SPD组与西洋参组比较,低、中剂量抗疲劳效果有非常显著性（P＜0.05）差异,高剂量抗疲劳效果略优（P＞0.05）。结论：0.5～1.0 mmol/（kg·d） SPD可以增加抗氧化酶的活性,减少自由基的积累,提高骨骼肌细胞膜代谢能力和抗损伤能力,显著推迟小鼠疲劳发生。     

PVPP对啤酒中多酚类物质和蛋白质的吸附作用比较

为了比较PVPP对啤酒中多酚类物质和蛋白质的吸附作用,以牛血清蛋白为例,采用PVPP分别处理原啤酒、牛血清蛋白(BSA)溶液以及BSA原啤酒混合溶液。实验发现,在相同条件下,尽管PVPP对牛血清蛋白具有较强的吸附作用,但对啤酒中多酚类物质的吸附作用更强;而在BSA原啤酒混合溶液中,多酚类物质被吸附量远远大于牛血清蛋白。结果表明,多酚类物质通过竞争吸附占据PVPP的吸附活性点。     

分子印迹固相萃取-化学发光法测定蔬菜中的马来酰肼

马来酰肼对高良姜素-高锰酸钾-多聚磷酸体系的化学发光具有增敏作用,据此结合分子印迹固相萃取技术建立测定蔬菜中马来酰肼含量的流动注射-化学发光分析方法。以马来酰肼为模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,偶氮二异丁腈为引发剂,用热聚合法合成了马来酰肼分子印迹聚合物,并以此分子印迹聚合物作为固相萃取填料制成固相萃取柱,对样品进行固相萃取后进行发光检测。在最优条件下,相对化学发光强度与马来酰肼的质量浓度在5.0×10-5～3.0×10-2mg/mL范围内呈良好的线性关系,检出限2.6×10-5mg/mL(3σ),相对标准偏差2.7%(1.0×10-3mg/mL马来酰肼,n=10)。将该法应用于马铃薯、洋葱及大蒜中马来酰肼含量的测定,加标回收率在95.2%～111.7%之间,相对标准偏差分别为1.8%、2.4%和2.1%。     

DETERMINATION OF ANIONS IN BEER BY ION CHROMATOGRAPHY

A method relying on ion chromatography, with suppressed ion detection, for the determination of anions in beer, has been collaboratively tested by members of the American Society of Brewing Chemists, the European Brewery Convention and the Brewery Convention of Japan. Precision values obtained for the determination of chloride, sulphate and phosphate in beer were judged to be acceptable. Repeatability (r₉₈) and reproducibility (R₉₈) values for chloride were 5.7, 12.6, 12.5 and 15.0, 38.4, 36.8 respectively at corresponding mean levels of 68.7, 218.6 and 322.5 mg/litre. r₉₈ and R₉₈ values for sulphate were 7.5, 6.2, 7.6 and 44.8, 54.0, 46.5 respectively at corresponding mean levels of 101.4, 205.1 and 122.6 mg/litre. r₉₈ and R₉₉ values for phosphate were 14.1, 11.9, 24.9 and 78.7, 53.8, 84.0 at corresponding mean levels of 411.5, 224.1 and 397.5 mg/litre. Whilst the r₉₈ value for nitrate was acceptable, the value for R₉₈ was unsatisfactory. The ion chromatographic method for determining chloride, sulphate and phosphate in beer is recommended for use and inclusion in Analytica -EBC as an International Method.