淡紫紫孢菌的筛选、鉴定及产壳聚糖酶固体发酵条件优化

目的:从全国各地土样中分离纯化出一株产壳聚糖酶活性较高的真菌M7a,并优化其固体发酵产酶条件。方法:综合形态学观察和18S rDNA序列测定进行鉴定,采用单因素和响应面设计确定其最佳固体发酵产壳聚糖酶条件。结果:菌株M7a被鉴定为淡紫紫孢菌,其最佳固体发酵产壳聚糖酶条件为:10 g/L胶体壳聚糖+5 g/L葡萄糖,10 g/L蛋白胨,豆粕麸皮质量比7∶5,初始pH值为6.0,发酵温度33℃及发酵时间5.5 d。产壳聚糖酶优化后达到16.80 U/mL,是初始条件的5.1倍。SDS-PAGE和酶谱分析发现该菌株产胞外分子质量为40.0 ku的壳聚糖酶,且无同工酶。结论:本研究筛选鉴定出一株新颖且产壳聚糖酶活力较高的淡紫紫孢菌M7a,优化了固体发酵条件,提高了产酶水平,为淡紫紫孢菌壳聚糖酶的分离纯化和应用提供了理论基础。     

1 株产壳聚糖酶细菌的分离、鉴定和发酵条件优化

从烟台海岸带沙质土壤中分离筛选壳聚糖酶产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其发酵条件,为酶法生产壳寡糖提供技术依据。通过透明圈法初步判断产酶能力,液体发酵复筛测定酶活力,筛选到酶活力达36.20 U/mL的菌株amyP216。通过菌体形态、菌落特征、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定菌株amyP216为莫哈韦芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。通过单因素和正交试验确定最佳发酵条件为：胶体壳聚糖添加量20 g/L、酵母浸粉添加量12.5 g/L、吐温-80添加量1.0 g/L、初始发酵pH 6.0、发酵温度30 ℃。在最优条件下利用5 L自控发酵罐培养45 h壳聚糖酶活力可达到80.60 U/mL,较优化前（36.20 U/mL）提高了1.2 倍。莫哈韦芽孢杆菌amyP216是一株壳聚糖酶活力较高的生产菌株,具有潜在的研究和应用价值。     

高产β-甘露聚糖酶黑曲霉菌株的分离与鉴定

该研究以采集的河南南阳魔芋种植土壤样品为试验材料,通过富集培养、测定产β-甘露聚糖酶酶活力,分离筛选高产β-甘露聚糖酶的菌株,并通过形态观察、内转录间隔区（ITS）基因和β-微管蛋白基因BenA序列分析对其进行菌种鉴定。结果表明,筛选得到一株高产β-甘露聚糖酶真菌菌株HKS016,其β-甘露聚糖酶酶活力为2.67 U/mL,该菌株被鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）,保藏于中国普通微生物学菌种保藏中心（CGMCC）,保藏编号为CGMCC No.22413。     

复合诱变选育壳聚糖酶高产菌种及产酶条件优化

以具有产壳聚糖酶能力的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）G10为出发菌,利用紫外和微波对菌株G10进行复合诱变,选育壳聚糖酶高产菌株,并采用正交试验设计对突变株产酶条件进行优化。结果选育出一株产酶活相对较高的突变株W1-32,优化后的产酶条件为果糖1.3%,胶体壳聚糖0.5%,酵母粉2.0%,MgSO4·7H2O 0.3%,初始pH 7.2,温度28 ℃,转速200 r/min。在此优化条件下,菌株W1-32产壳聚糖酶活为11.82 U/mL,是出发菌株G10的6.9倍。该研究为菌种的选育和进一步研究应用提供理论依据。     

高产β-甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究

通过初筛和复筛从魔芋种植基地土壤样品中分离筛选高产β-甘露聚糖酶菌株。通过形态学观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,并对其产β-甘露聚糖酶酶学性质进行研究。结果表明,筛选出一株高产β-甘露聚糖酶的菌株,编号为HTGC-10,被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株HTGC-10在30 ℃、180 r/min条件下液体发酵24 h后,发酵液β-甘露聚糖酶活力为61.75 U/mL。酶学性质的研究结果表明,该菌株所产酶的最适反应pH值为6.0,在中性偏酸环境下稳定性较好,属于偏酸性酶;最适反应温度为55 ℃,热稳定性相对较差;乙二胺四乙酸（EDTA）和金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著。     

Bacillus sp.AA5所产壳聚糖酶的纯化及性质研究

纯化Bacillussp.AA5所产的壳聚糖酶,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的分子量大约为38.1kDa。同时对其酶学性质进行了初步研究,发现该壳聚糖酶在4℃下10d内稳定性良好,酶的最适温度和pH值分别为43℃和7.0,Ca2 、Mg2 、Ba2 对它的酶活有不同程度的促进作用。     

一株产壳聚糖酶芽孢杆菌的分离及鉴定

采用透明圈法,从黄河三角洲地区的腐败落叶分离出9株产壳聚糖酶的菌株。再经菌株分离纯化、液体发酵复筛及酶活研究,确定其中1株为壳聚糖酶高产菌株,命名为XHT-0903。通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析进行菌株鉴定,确定XHT-0903为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。其液体发酵酶活力达20 U/mL,具有较好的开发及应用价值。     

南极磷虾壳聚糖、壳寡糖的制备与品质鉴定

本研究以南极磷虾壳为原料,制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,并对二者的品质进行鉴定。南极磷虾壳经脱钙、脱蛋白处理,探索脱乙酰反应条件（碱溶液浓度、反应温度与反应时间）,制备具有较高脱乙酰度的南极磷虾壳聚糖,并对壳聚糖的理化指标进行鉴定;探索酶法降解条件（壳聚糖酶添加量、酶解时间）,制备较高纯度的南极磷虾壳寡糖,并对壳寡糖的结构特征进行鉴定。结果表明,使用60%的氢氧化钠于110 ℃脱乙酰处理4 h制备的南极磷虾壳聚糖脱乙酰度为85.74%,粘均分子量为 305.65 kDa,水分含量4.66%,灰分含量0.98%,酸不溶物含量0.40%,各项理化指标均符合食品级壳聚糖的要求;使用壳聚糖酶水解南极磷虾壳聚糖制备壳寡糖,在壳聚糖酶添加量为0.2% （m/V）,酶解16 h条件下,南极磷虾壳寡糖产品得率为46.0%,红外光谱与NMR谱图显示了表征壳寡糖结构的全部特征峰,质谱结果显示南极磷虾壳寡糖主要由二糖(GlcN)₂、三糖(GlcN)₂-GlcNAc与四糖(GlcN)₃-GlcNAc构成。本研究通过制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,为南极磷虾壳的高值综合利用与南极磷虾新产品开发提供了技术支持。     

ARTP诱变对Bacillus Cereus产壳聚糖酶酶学性质的影响

壳寡糖由壳聚糖酶水解壳聚糖而成,普遍应用于工业、农业、食品、医学等多个领域.但壳聚糖酶酶活普遍不高,因此,以前期研究获得的一株产壳聚糖酶的蜡样芽孢杆菌为材料,运用常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)诱变技术进行处理,诱变后壳聚糖酶较原始壳聚糖酶酶活更高,具...     

碱性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

为获得具有潜在工业应用价值的碱性β-甘露聚糖酶产生菌株,从自然土样中分离得到1株产酶性状较好的碱性细菌,经形态学和分子生物学分析鉴定为科氏芽孢杆菌(Bacillus cohnii)。粗酶性质研究显示,该菌株所产β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别在55℃和9. 5。通过单因素和正交设计试验优化后,该菌株摇瓶发酵至36 h时,产酶水平为345 U/L,是优化前产酶水平的4. 3倍。研究结果为碱性β-甘露聚糖酶的放大发酵奠定了基础,为碱性β-甘露聚糖酶编码基因的克隆及异源表达等相关研究提供了良好的菌种资源。     

高产蛋白酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

该研究旨在从非传统环境（磷矿）中分离、筛选高产胞外蛋白酶菌株，对菌株进行形态学观察、生理生化和分子生物学鉴定，并研究其蛋白酶的酶学性质。结果表明，分离筛选到一株蛋白酶高产菌株，编号为PB5，该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株产胞外蛋白酶活力为562.3 U/mL，胞外蛋白酶的最适pH值为10，在pH 7～10有较好的pH稳定性；最适温度为60 ℃，20～50 ℃时有较好的稳定性；Na+、Mg2+、Mn2+、K+对蛋白酶活力有明显的促进作用；Fe2+、Ag+、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸钠（SDS）对蛋白酶活力有明显抑制效果。     

纤维素酶高产菌筛选鉴定及酶学性质初步研究

该研究从土壤中筛选出一株纤维素酶高产菌株SP08,并通过菌落形态特征和ITS测序技术对菌株进行鉴定,最后通过酶促反应初步测定了该菌所产纤维素酶的性质。结果表明,筛选得到菌株SP08,经鉴定为康氏木霉（Trichoderma koningii）,该菌株具有较高的纤维素酶产酶能力,培养60 h时纤维素酶活性即达（18.54±0.75）,72 h时酶活达到最高（19.18±0.68）U/mL。酶学研究表明,菌株SP08所产纤维素酶最适温度和pH分别为50 ℃和5.5,在20～50 ℃及pH4.0～6.0时稳定性较高;Mg2+、Mn2+和Ca2+能够提高该酶活性,而Fe2+和Cu2+却对该酶具有抑制作用。     

一株褐藻酸裂解酶高产菌的筛选及其酶学性质研究

从腐烂的海带中筛选出一株褐藻酸裂解酶（Aly）高产菌,经形态学分析、生理生化特征和分子水平鉴定,该菌为交替假单胞菌属,命名为Pseudoalteromonas sp. EE258。利用硫酸铵沉淀、快流速DEAE-琼脂糖凝胶（DEAE-sepharose Fast Flow）和丙烯葡聚糖凝胶（Sephacryl S-100）柱层析等方法,对Pseudoalteromonas sp. EE258产生的褐藻酸裂解酶Aly-EE258进行分离纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定该酶的分子质量为23 ku。酶学性质研究显示：该酶的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH值为7.0,在20 ℃以下时稳定性较好,Ca2+和Ba2+能明显提高酶的活性,Fe2+、Al3+、Mg2+和乙二胺四乙酸（EDTA）抑制酶的活性。Aly-EE258能不同程度地裂解褐藻酸、聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸,其中聚甘露糖醛酸裂解后主要产生单一的低聚寡糖,在实际应用方面具有重要意义。     

一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的Rhodococcus hoagii筛选、鉴定及酶学性质

从连云港高公岛海域采集的海泥中使用平板变色圈法初筛和摇瓶发酵复筛后,获得一株产几丁质脱乙酰酶的菌株MCDAⅡ-2。综合形态学特征以及16SrDNA序列分析最终将菌株MCDAⅡ-2鉴定为Rhodococcus hoagii。进而研究其酶学性质,得该几丁质脱乙酰酶最适催化温度为35℃,最适pH为8.0。Na^+、Mg^2+、Li+、Sr^2+对酶促反应起到促进作用,Ca^2+、Ba^2+、Co^2+、Cd^2+、Fe^2+及EDTA对酶促反应起到了抑制作用,而K^+对酶促反应影响较小。酶在25℃~35℃时较稳定,在中性和弱碱性条件下稳定性较好。本次研究的结果将为几丁质脱乙酰酶的工业化应用奠定基础。     

黑曲霉突变菌株产糖化酶的酶学特性表征

以电子束诱变黑曲霉突变菌株为对象,通过最适pH试验、最适作用温度试验、热稳定性试验、酸碱稳定性试验和金属离子对糖化酶活力影响的试验,探明黑曲霉电子束突变菌株产糖化酶的酶学特性。结果表明:突变菌株产糖化酶酶最适作用温度为63℃,且最高酶活较原始菌株提高26%,在80℃原始菌株所产糖化酶失活时,仍有8.4 kU/mL酶活剩余,突变菌株所产的糖化酶的热稳定性明显提高。突变菌株所产糖化酶最适pH为4.6,且最高酶活较原始菌株提高24%,在原始菌株所产糖化酶失活时仍有6.9 kU/mL酶活剩余,突变菌株糖化酶的pH稳定性有着明显提高。K+、Mg2+、Ca2+可在一定程度上增强其活力;Ag+、Fe2+、Cu2+则在不同程度上抑制糖化酶活力;Zn2+、EDTA对其酶活力影响较小或无明显现象。     

海洋高产低温葡萄糖氧化酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

从黄海和渤海海泥样品中筛选高产低温葡萄糖氧化酶（GOD）菌株并进行鉴定,对其所产GOD的蛋白分子质量和酶学性质进行初步研究。获得一株高产葡萄糖氧化酶菌株（编号G01）,根据菌株形态特征及ITS序列分析,初步鉴定该菌株为壳青霉（Penicillium crustosum）。结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶谱分析,得出菌株G01所产葡萄糖氧化酶分子质量约为95 ku,初步判断为五聚体,为一种新酶。酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为25 ℃,在0 ℃时仍保留有50%以上的酶活,热稳定性差,为典型低温酶;最适反应pH值为4.5,对pH敏感;Mn2+能促进酶活,K+、Na+对酶活基本无影响;而Mg2+、Ca2+、NH4+、Cu2+、特别是Fe3+对酶活有明显抑制作用。酶学性质表明该酶作为一种新酶,在低温和水产饲料领域有良好应用前景。     

一株产高活性多酚氧化酶菌株筛选鉴定及其酶学性质

采用变色圈法从土壤样品中分离筛选产多酚氧化酶的菌株,对其进行形态学观察、分子生物学鉴定,并对其所产多酚氧化酶的酶学性质进行研究。结果表明,筛选得到1株产多酚氧化酶活性较高的菌株,命名为ZL-2,其被鉴定为竹黄菌属（Shiraia sp.）。菌株ZL-2发酵8 d产多酚氧化酶酶活最高,达到521 U/mL。菌株ZL-2产多酚氧化酶最适底物为邻苯二酚,其最适pH值为6、最适温度为30 ℃;酶活在温度20～40 ℃及pH 3～6范围内稳定。金属离子Cu2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+对多酚氧化酶都有激活作用,其中Cu2+激活作用最强;Ca2+、Al3+对酶活有一定抑制作用;L-抗坏血酸和亚硫酸氢钠对该酶抑制作用较强。