原生质体电融合选育维生素K2高产菌株

试验采用双亲灭活原生质体电融合选育维生素K2高产菌株,探究了灭活和电融合条件。结果表明:经热灭活和紫外灭活后,在成串脉冲频率2 MHz,成串电压32 V,脉冲融合电压500 V,脉冲宽度40μs,脉冲个数6个的条件下进行电融合,筛选得到一株优良菌株BKU-6,其维生素K2的产量达到39.6 mg/L,远高于产量低的亲本菌株CICC10262。     

高产碱性蛋白酶解脂耶罗维亚酵母菌选育及培养基优化

以解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）ZJ059为出发菌株,利用紫外线（UV）-氯化锂（LiCl）复合诱变处理,筛选出遗传性状稳定、高产碱性蛋白酶的突变菌株F053。以碱性蛋白酶产量为指标,对菌株F053进行培养基优化,经过单因素试验及正交优化试验,确定最佳碱性蛋白酶培养基成分为葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、硫酸钙0.075%;在此优化条件下,碱性蛋白酶产量高达44.39 U/L,与出发菌株相比,碱性蛋白酶产量提高20.46%。     

电融合原生质体构建麦角甾醇酵母菌株的研究

实验采用细胞电融合技术进行麦角甾醇酵母菌株构建研究,在不同种属的酵母菌种进行筛选研究,确定麦角甾醇含量较高酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和细胞生物量较高产朊假丝酵母(Candi-dautilis)为亲本菌株,进行原生质体制备、原生质体再生、原生质体灭活和原生质体融合研究,确定电融合过程中电压、脉冲强度、脉冲间隙及脉冲次数等技术参数,并筛选出融合子PF-4。经发酵性能实验表明,PF-4的细胞生物量为33.17g/L,麦角甾醇含量为2.01%,均高于亲本菌株,为玉米发酵法制备麦角甾醇酵母提供生产菌株。     

川藏高原冰葡萄中五种酵母菌的鉴定及耐受性研究

从川藏高原地区采摘的冰葡萄果实中分离纯化出了葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）5种菌株,采用18SrDNAD1/D2序列对菌株进行了鉴定,并对其耐受性进行了研究比较。结果表明：葡萄汁有孢汉逊酵母对蔗糖、乙醇和碱表现出较强的耐受性;酿酒酵母对酸表现出相对较好的耐受性;异常威克汉姆酵母对低温和二氧化硫表现出较强的耐受性。     

基因组改组快速提高谷氨酸棒杆菌L-鸟氨酸产量

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌,应用基因组改组技术快速提高L-鸟氨酸产量。经过紫外线、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得6株产量有所提高的突变株,以此构建用于基因组改组的候选菌库。考察培养基成分对原生质体再生率的影响。经过两轮的灭活原生质体递推式融合,以磺胺胍和氟化钠为双抗性筛选标记,共筛选出2株遗传性能稳定的改组菌株。其中改组菌株F2-6摇瓶发酵72h,积累L-鸟氨酸产量为2.99g/L,是出发菌株的13.6倍。结果表明基因组改组技术能够在短期内使谷氨酸棒杆菌的L-鸟氨酸产量得以提高。     

原生质体电融合法构建葡萄酒降酸酵母的研究

以发酵性能优良的葡萄酒酵母F83和具有降解苹果酸能力的酒类酒球菌作为亲本菌株,进行电融合,构建发酵性能良好且具有降解苹果酸能力的葡萄酒酵母菌株.结果表明,两亲本菌株原生质体电融合的最佳条件为:交变电压55 V,交变电场频率1000 kHz,脉冲宽度30μs,脉冲个数5个.共获得13株融合株,其中10号融合子发酵、降酸性能较佳.     

应用基因组改组选育耐糖L-乳酸高产菌株

本研究应用基因组改组提高鼠李糖乳杆菌的耐糖能力,进而提高L-乳酸的产量。通过紫外线和亚硝基胍诱变方法获得8株改良出发菌株。考察了氨基酸前处理和变溶菌素对原生质体形成的影响。利用双亲灭活的原生质体进行递进式融合,经过两轮基因组改组和碳酸钙高糖平板及瓶筛选,选育出了耐糖改组菌株F2-2。在初糖浓度为150g/L发酵罐中,F2-2的乳酸产量为140g/L,是野生型乳杆菌的1.8倍。结果表明基因组改组技术能够快速提高乳酸菌耐糖和产酸能力两个表型。     

乳酸乳球菌与酵母菌混合培养时菌间的相互影响

研究了干酪常用发酵剂——乳酸乳球菌与干酪中两株常见酵母菌——耶罗解脂酵母及汉逊德巴利酵母混合培养时的相互影响.在营养肉汤中对三株菌单独及混合培养,比浊法测定其生长浓度,同时在脱脂乳培养基中做相同培养,然后检测活菌数、球菌产酸及菌株自溶情况.结果表明:乳酸乳球菌、耶罗解脂酵母及汉逊德巴利酵母三株菌混合培养时其菌数及自溶度,均有显著增加,表明混合培养加快了菌株生长代谢的速率.这对研究干酪促熟及风味调整具有重要意义.     

低能离子注入对产胡萝卜素红酵母NR06的诱变效应研究

分别以红酵母NR06和其原生质体为研究对象,通过注入生命必需元素N 以期获得高产类胡萝卜素突变株.结果表明,原生质体在各种注入剂量下的存活率几乎均为零,说明在所实验的条件下原生质体不宜用于离子注入诱变育种.但对红酵母细胞直接诱变时,当注入剂量为12×1014N /cm2时,获得一株高产类胡萝卜素突变株L15,其β-胡萝卜素产量可达8.0mg/L,比出发菌株NR06提高了34.5%,并且该高产菌株遗传性能较为稳定.     

高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育

为提高季也蒙毕赤酵母和休哈塔假丝酵母代谢木糖生产乙醇能力,采用原生质体融合以及化学及物理诱变方法进行育种,得到五个乙醇产量较高的菌株XX2,X1,X4,X12和X13.说明原生质体融合和诱变育种是筛选高效菌种的有效途径.     

解脂耶罗维亚酵母菌利用地沟油联产柠檬酸和胞内油脂

以地沟油为原料,以解脂耶罗维亚酵母菌(Yarrowia lipolytica)为发酵菌株,进行柠檬酸和胞内油脂的同时发酵。结果发现,发酵过程中柠檬酸和胞内油脂同时保持较高产量的最佳发酵条件为:接种量为5×108个细胞/L培养基,碳源质量浓度为80.0 g/L,摇床培养转速为180 r/min。在该条件下,柠檬酸和胞内油脂的产量分别达到33.6 g/L和44.9 g/100 g(细胞干重)。进一步研究发现,Y.lipolytica以地沟油为原料合成柠檬酸和胞内油脂的发酵过程包括3个阶段:细胞生长阶段、油脂合成阶段和柠檬酸合成阶段。地沟油转化为胞内油脂后,其脂肪酸饱和程度降低。     

利用全基因组改组技术提高SubtilosinA的产量

以Bacillus subtilis nja A1B2-2为出发菌株,在最佳的原生质体形成、再生和融合条件的基础上,将前期经过理化诱变筛选的四株高产菌株进行两轮基因组改组。结果表明,当以0.6mol/L Na Cl为高渗洗涤液,0.1mg/m L溶菌酶酶解40min后,涂布在以SMM为高渗体系的NB再生培养基上,原生质体形成率达到95.49%,再生率为89.25%。优化原生质体的融合条件,融合率达到了1.39×10-3。在此基础上将四株高产Subtilosin A菌株进行两轮全基因组改组,结合双亲灭活的筛选方法,挑选出一株遗传性状稳定的高产菌株R2-264,产量达17.59mg/L,比出发菌株提高了3.58倍。     

外源底物亚油酸对解脂耶氏酵母重组菌株合成共轭亚油酸的影响

为了提高解脂耶氏酵母重组菌株的反-10,顺-12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)产量,采用YNBDL培养基进行摇瓶发酵,考察了在培养基中添加不同纯度的亚油酸对解脂耶氏酵母合成t10,c12-CLA的影响。结果表明:亚油酸纯度的提高对菌株的生长和产脂未产生影响,且t10,c12-CLA的产量随亚油酸纯度的增加而提高,最高产量可达3.7 g/L;用大豆油替代培养基中的亚油酸,t10,c12-CLA的转化率从20%提高至25%,菌株生长、产脂及t10,c12-CLA产量与添加纯度为65%亚油酸的结果相近。实验证明解脂耶氏酵母重组菌株能够高效转化富含亚油酸的植物油合成t10,c12-CLA。     

抗食品腐败酵母的乳酸菌的筛选与鉴定

本文筛选了能够抑制食品中典型腐败酵母的乳酸菌,研究其抑制特性并进行了分子生物学鉴定。从泡菜,榨菜、酸奶、火腿等食品中分离得到乳酸菌57株,通过双层拮抗平板法筛选能够抑制食品中典型腐败酵母（假丝酵母属、毕赤酵母属,酵母属、蔷薇酵母属和解脂耶罗维亚酵母）的乳酸菌6株,其中菌株AT 6能够抑制所有11株腐败酵母指示菌。96孔板法测定乳酸菌AT6发酵上清液对腐败酵母的抑制率可达73.04%以上,其抑制活性对蛋白酶不敏感,但随着pH值的升高而降低。菌株AT6在MRS培养基中的生长曲线研究表明30 ℃静置培养30 h,其发酵上清液可达到对白色念珠菌的最大抑菌活性95.02%。提取菌株AT6基因组并扩增16S rRNA基因,将PCR片段克隆到pMD 19-T 载体后进行测序,BLAST分析和多重比对后确定AT6为食窦魏斯氏菌。     

原生质体紫外诱变脂肪酶高菌株

以粗壮假丝酵母CJ107为出发菌株,对其进行原生质体紫外诱变选育.筛选得到10株脂肪酶活力比出发菌株高的突变株,其中菌株CJ-09的酶活达35.78U/mL,比CJ107提高了4.58倍.突变株CJ-09经10次传代,其脂肪酶酶活性保持稳定,为今后进一步研究不同的育种方法、进一步提高脂肪酶的产量打下基础.     

原生质融合选育高产赤藓糖醇菌株的研究

在实验室经紫外诱变方法筛选到28株赤藓糖醇产生菌优良菌株基础上,采用原生质体电融合技术构建高产赤藓糖醇工程菌,对在实验过程中影响原生质体形成的各种因素以及影响电融合的各项参数进行初步研究,研究表明:酶解浓度为0.25%,酶解时间为20min,酶最适宜作用温度为35℃,最适pH值5～6。确定了最佳融合参数:交变电场强度为250V/cm,脉冲强度为6kV/cm,脉冲时间为30μs,脉冲个数为5个。融合菌株赤藓糖醇产量为120.6g/ml,葡萄糖转化率为53.2%。     

降解赭曲霉毒素A菌株的筛选及其鉴定

为了提供筛选生物降解赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）的便利条件,优化水系中OTA的测定方法。通过在水系中添加甲醇或乙醇的方法,使得水系中OTA回收率超过了90%,此外通过对比,当甲醇或乙醇与样液体积比为1∶1时,足以准确测定水系中OTA含量。利用以上方法对降解OTA的菌株进行筛选,发现细菌B-1和酵母Y-2均能够降解OTA,且细菌B-1在2 d时能降解87%的OTA,3 d将OTA全部降解,而酵母Y-2在2 d时就能够降解84%的OTA,在后续的培养中维持降解率不变。此外,利用液质联用法进一步确定了菌株B-1和Y-2的降解作用,并分析了降解产物。最后,通过分别分析细菌B-1和酵母Y-2的16S rDNA和ITS rDNA序列,菌株B-1鉴定为泡囊短波单胞菌,菌株Y-2鉴定为耶罗维亚酵母。     

基因改组选育高产杆菌肽地衣芽孢杆菌及改组菌株差异分析

为了提高地衣芽孢杆菌肽产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育。以地衣芽孢杆菌TJ12为原始菌株,通过紫外诱变、亚硝基胍诱变、常压室温等离子体诱变构建了TJ12菌的突变体库。在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4 株诱变菌株（U11、U23、H1、L71）作为亲本,采用聚乙二醇介导的方法进行3 轮多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,最终选出1 株杆菌肽产量提高并能稳定遗传的优良菌株F3,对其摇瓶发酵36 h,杆菌肽A产量达760 mg/L,为野生菌株TJ12的1.7 倍。与野生菌株TJ12相比,改组菌株提前进入生长稳定期,两者发酵过程pH值几乎无差异;最终改组菌生长量虽低于野生菌,但菌株单位细胞还原糖产量及杆菌肽产量都高于野生菌株;其合成基因和调控基因表达量相对野生菌株都上调,其中合成基因上调幅度较大。推测改组菌株自身有了更强大的杆菌肽耐受机制,且合成基因相关部位可能发生了改变。     

多亲本原生质体融合构建高产谷胱甘肽菌株

基于多亲本原生质体融合技术提高酿酒酵母Y518产谷胱甘肽能力。结果表明,酿酒酵母Y518培养8h,经0.15%巯基乙醇前处理,酶解(酶浓度17.5g/L)60min,原生质体形成率达90%以上;在40% PEG6000(含5g/LCaCl2)诱导下融合,融合率可达2.6×10-5;通过4轮基因组改组,得到2株GSH产量提高的突变菌株,最高可达15.92mg/g,为原始菌株的2倍。     

诱变与原生质体融合联合选育异抗坏血酸发酵菌株的研究

采用诱变与原生质体融合技术联合筛选高产异抗坏血酸发酵菌株.通过紫外诱变与硫酸二乙酯诱变对出发菌株FZ-13进行诱变选育,再利用具有抗药性标记的亲本进行原生质体融合筛选出高产且遗传稳定性好的异抗坏血酸发酵菌株.通过诱变筛选出了产量比FZ-13提高200％～473％的27株青霉菌株;通过原生质体融合试验,筛选到产量比FZ-13高563.7％的菌株L11,L11的产量最高为6.93mg/mL,且遗传性状稳定.诱变能有效提高异抗坏血酸发酵菌株的产量,同时原生质体融合技术也可用来提高异抗坏血酸发酵菌株的产量.