球孢白僵菌几丁质酶基因chit1真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chit1,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

球孢白僵菌几丁质酶基因chitl真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chitl,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

福寿螺多功能纤维素酶EGXA在酿酒酵母中的表达

研究在酿酒酵母中表达福寿螺内源性纤维素酶基因egxa cDNA。结果显示：重组酶水解对一硝基酚纤维二糖苷（pNPC）、微晶纤维素（sigmacell）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）以及Oatspelt的木聚糖（xylan from oat spelt，麦木聚糖）等4种底物的活力分别为1．25，84，70和196U／L，并发现了天然信号肽，酵母性因子信号肽（MRl）对重组酶表达的影响。     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌(IAM11001)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB,构建具T7强启动子的PET-20-(b)-BgaB质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，经IPTG诱导的后，重组菌周质中乳糖酶酶活达到0.12U/mL，胞内酶活为1.35U/mL，比酶活为6.66U/mg蛋白，比酶源菌产生的酶活提高5倍，通过对IPTG诱导时机，诱导浓度和诱导时间的优化研究，重组细菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的90倍。     

蔗糖转化酶SUC2在商品化酿酒酵母中的高水平表面展示

蔗糖转化酶SUC2是酿酒酵母水解菊糖的关键酶,但SUC2在酿酒酵母中的低水平表达限制了其理性改造酿酒酵母以获得高效生产菊糖基乙醇工程菌的进程。本实验通过克隆获得蔗糖转化酶SUC2的编码基因,并利用AGA1-AGA2锚定蛋白复合体将SUC2表面展示于商品化酿酒酵母菌株EBY100中。酶活力测定结果表明,表面展示有SUC2的重组菌EBY-S蔗糖酶活及菊糖酶活分别达到241.6和9.4 U/mL,较之前报道的过表达SUC2的酿酒酵母重组菌酶活力有显著提高。该结果表明,AGA1-AGA2锚定蛋白复合体能够成功地将SUC2表面展示于酿酒酵母细胞壁上。     

产甘油假丝酵母胞浆3—磷酸甘油脱氢酶在甘油形成中的作用

为了研究胞浆３－磷酸甘油脱氢酶（ｃｔＧＰＤ，ＥＣ１．１．１．８）在产甘油丝酵母（ＣａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｇｅｎｅｓｉｓＺｈｕｇｅ）甘油合成机制中的作用，考察了发酵实验过程中ｃｔＧＰＤ的活力水平以及高渗环境对该酶酶活水平和甘油形成的影响，结果表明，该菌种ｃｔＧＰＤ的表达在相对低渗的发酵过程中处于一个较高的水平，并在３６ｈ和６０ｈ处分别出现两次峰值；高渗环境可使ｃｔＧＰＤ酶活增加，但幅度不大，发     

克鲁维酵母菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达

从菊粉酶酶源菌株克鲁维酵母GKluyveromyces marxianus)Y109中提取菊粉酶基因，PCR扩增Y109的菊粉酶基因inuB1，核苷酸序列测定分析表明inuB1的阅读框架全长1665bp，没有内含子，其中存在4个潜在的N一糖基化位点。以pPIC9K为表达载体，构建inuB1的酵母转化载体，转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，获得菊粉酶基因工程菌GS115／inuB1。GS115／inuB1甲醇诱导发酵表达菊粉酶，inuB1基因重组胞外菊粉酶表观分子量为90kD(SDS-PAGE)，比酶活性是12．29U／mg。     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

K氏酵母与清酒酵母产孢率的研究及原生质体制备

本文考察了Ｋ氏酿酒酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫ）与清酒酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓａｋｅＹａｂｅ的最适产孢前培养条件与最适产孢培养条件，以及二者原生质体的制备条件，并对二者的融合进行了初步的研究，试验表明：二供试菌经产孢前培养基Ⅱ和１号产孢培养基培养可获得较高产孢率；并且最适产孢温度为２８℃；用２％蜗牛酶于３１℃酶解３ｈｒ，可除去子囊壁，收集原生质体；用４％蜗牛酶，３３℃酶解２－３ｈｒ，制备原生质体；进一步试验表明，Ｋ氏酿酒酵母与清洒酵母可以进行原生质体融合，且得到一融合子Ｆ＿１．     

基于重组毕赤酵母的2-癸烯酸生物合成研究

2-癸烯酸是一种具有2位不饱和键的中链脂肪酸,是合成功能化合物10-羟基-2-癸烯酸的重要前体物质.本研究首先将硫脂酶基因YdiI和脂肪酸CoA脱氢酶基因FadA分别连接至具有pGAP启动子的pGAPZαA载体上,并电转化至毕赤酵母GS115感受态中,经过Zeocin抗性筛选及基因组PCR鉴定后,成功获得重组载体同源重...     

酿酒酵母与糖化酵母原生质体的形成与再生

对影响酿酒酵母及糖化酵母形成与再生的因素——菌龄、酶浓度、温度、酶解时间、预处理剂的浓度和作用时间及渗透压稳定剂的选择做了初步的研究，确定了原生质体形成与再生的最佳条件：菌龄为13～15h，0．1％β-巯基乙醇作用10min；在30℃下，2．0％的蜗牛酶酿酒酵母、糖化酵母酶解1．0h；配制酶解液时渗透压稳定剂采用0．8mol／LKCl，而在稀释及配制再生培养基时则采用0．53mol／L蔗糖。     

康宁木霉cbh2基因在毕赤酵母中的表达

为拓宽酵母菌的应用领域,构建具有分泌纤维素酶能力的酵母工程菌,利用质粒pPICZαA构建了康宁木霉纤维素酶cbh2基因的酵母表达载体,经线性化后采用电穿孔法转入毕赤氏酵母菌中.以甲醇为诱导物进行诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果证明该基因可成功表达.对重组蛋白进行了产酶活性测定,结果证明该重组蛋白具有纤维二糖水解活性,从而获得了一株可产生纤维素酶的酵母工程菌.     

酸性β-半乳糖苷酶基因密码子优化及高效表达

选用酵母偏好密码子,设计合成一种酸性β-半乳糖苷酶基因,并研究其在毕赤酵母中的高效表达。优化后,密码子适应指数(CAI)由原来的0.61提升到0.85。在基因的5'端融合编码α信号肽序列,在3'端融合编码6个组氨酸标签序列,并在N端编码α信号肽和编码成熟酸性β半乳糖苷酶基因间分别引入编码kex2和Ste13裂解信号序列。基因克隆到pPICZα-A表达载体,构建成分泌型重组酵母表达载体pPICZα-β-Gal。在醇氧化酶(AOX1)启动子调控下,酸性β-半乳糖苷酶得到高效分泌表达,达到508 mg/L,比优化前提高3倍。重组酸性β-半乳糖苷酶具有天然的酸性β半乳糖苷酶相同的酶活性。     

拟南芥谷氨酸-tRNA合成酶(AtGluRS)不能取代酵母GluRS

将拟南芥细胞质谷氨酸-tRNA合成酶（AtGluRS）引入酵母细胞，研究其与酵母GluRS进行功能互补的可能性．无功能的酵母GluRS会导致酵母细胞死亡．将携带AtGluRS的pACT2-AtGluRS或pBridge（dNLS）-AtGluRS表达载体转化到含有能表达酵母谷氨酸．tRNA合成酶的pRS316-yGluRS载体的gluRS缺陷型酵母菌株中，若拟南芥GluRS能取代酵母中的该同源蛋白，酵母细胞中的载体pRS316-yGluRS在非选择性培养条件下将会很快丢失．然而，在经过3d的非选择性培养后，发现酵母细胞没有因拥有AtGluRS而失去提供GluRS功能的载体pRS316-yGluRS．可见，不同物种的GluRS之间，即使其具有很高的同源性，它们在演化过程中可能已形成了各自不同的特性，导致了拟南芥AtGluRS不能对酵母GluRS起功能互补作用．提示一些同源蛋白在异源生物体中不能发挥其正常功能．     

耐高温α—淀粉酶产生菌B.sp—JF1的诱变选育

通过采用紫外线（ＵＶ）、亚硝基胍（ＮＴＧ）和甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）等理化方法对可产生耐高温α－淀粉酶的高温菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ－ＪＦ１进行诱变选育，得到酶活提高为原菌２．２３倍的一株突变株，命名为Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ－ＪＦ１ＵＥＮ－Ｔｒ＾ｒ－３。     

人源蛋白酶体α亚基6的酵母表面展示及表达优化

为构建人源蛋白酶体α亚基6（hPSA6）的酵母表面展示体系用于抗体表位分析和研究泛素-蛋白酶体途径，并优化hPSA6的展示表达，将基因PSA6_HUMAN克隆于表达载体pICAS—H，该载体带有His．tag标签可检测表达水平．经过重组酵母的培养，用抗His．tag或抗hPSA6的单克隆抗体和荧光二抗进行免疫荧光染色，通过流式细胞仪和荧光显微镜检测到hPSA6已经成功地展示于酿酒酵母表面．通过对培养基中不同初始浓度的葡萄糖和酸水解酪紊的诱导培养，发现hPSA6呈现出不同的展示水平，与对照相比，对His．tag进行免疫荧光检测观测到3％酸水解酪素诱导培养可获得超过70％的展示表达率，3％葡萄糖诱导培养可达到50％以上表达率，2％葡萄糖诱导也有接近40％表达率．考虑到葡萄糖效应和灭菌过程中高浓度的葡萄糖易碳化，采用2％葡萄糖进行诱导表达较3％更适合于hPSA6的展示表达．     

人参DS和D12H基因的异源共表达

利用RT-PCR技术和酶切连接技术克隆得到人参皂苷生物合成关键酶DS和D12H基因,并构建出两种基因的表达载体DS-pAUR123和D12H-pAUR123。通过热转化法将两个表达载体转化到酿酒酵母中,得到重组工程菌。两种基因在重组工程菌中能够表达出具有催化功能的活性蛋白质,实现了人参DS和D12H基因的异源共表达。     

果实特异性启动子驱动丙型肝炎病毒E2基因植物表达载体的构建

构建了果实特异性启动子驱动的含编码丙型肝炎病毒包膜蛋白E2基因的植物表达载体,为研制有效的转基因植物丙肝疫苗打下基础。以载体pCAMBIA2300为骨架引入pBIl21中的GUS基因,用目的片段E2基因替换其中的GUS基因构建了pCAM-BIA2300G-E2载体,将番茄的果实特异性启动子E8引入pCAMBIA2300G-E2载体中构建了pE8-E2植物表达载体。用限制性内切酶消化重组载体,结果表明重组载体都含有所插入的目的片段。果实特异性启动子驱动的含E2基因的植物表达载体的成功构建,为抗丙型肝炎病毒的口服疫苗研究提供了试验基础。     

克鲁维酵母菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达

从菊粉酶酶源菌株克鲁维酵母GKluyveromycesmarxianus)Y109中提取菊粉酶基因,PCR扩增Y109的菊粉酶基因inuB1,核苷酸序列测定分析表明inuB1的阅读框架全长1665bp,没有内含子,其中存在4个潜在的N 糖基化位点。以pPIC9K为表达载体,构建inuB1的酵母转化载体,转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得菊粉酶基因工程菌GS115/inuB1。GS115/inuB1甲醇诱导发酵表达菊粉酶,inuB1基因重组胞外菊粉酶表观分子量为90kD(SDS PAGE),比酶活性是12.29U/mg。