血管紧张素-(1-7)/Mas受体轴通过调控NF-κB通路保护心肌细胞对抗高糖诱导的损伤

目的:探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]/Mas受体轴能否通过抑制核因子-κB(NF-κB)通路对抗高糖(HG)引起的心肌细胞损伤。方法:应用细胞计数检测试剂盒(CCK-8)检测心肌细胞存活率;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相法检测胞内活性氧(ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相测定凋亡细胞的形态及数量的变化;JC-1染色法测定线粒体膜电位(MMP);应用免疫蛋白印迹法测定NF-κB p65和cleaved caspase-3蛋白的表达水平。结果:应用35 mmol/L葡萄糖分别处理H9c2心肌细胞30、60、90、120和150 min均能明显增加磷酸化(p)NF-κB p65的水平,其中60 min时,表达水平增加最明显;1μmol/L Ang-(1-7)与HG共同处理心肌细胞60 min能抑制HG对p-NF-κB p65表达的上调作用;0.1~30μmol/L的Ang-(1-7)与HG分别共处理心肌细胞24 h均能抑制HG的细胞毒性,使细胞存活率增多;另一方面,1μmol/L Ang-(1-7)能抑制HG引起的细胞凋亡、氧化应激、线粒体损伤等,使凋亡细胞数量、cleaved caspase-3表达、ROS生成水平及MMP丢失减少;但是10μmol/L Ang-(1-7)/Mas受体拮抗剂A-779能明显阻断上述的Ang-(1-7)的心肌细胞保护作用;与Ang-(1-7)的作用相似,100μmol/L PDTC(NF-κB抑制剂)与HG共处理心肌细胞24 h也能显著抑制上述的HG损伤作用。结论:Ang-(1-7)/Mas受体轴可通过抑制NF-κB通路对抗HG诱导的心肌细胞损伤。     

血管紧张素-(1-7)通过抑制TLR4激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

目的:研究血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过抑制Toll样受体4(TLR4)激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤。方法:应用Western blot检测心肌细胞受体相互作用蛋白3(RIP3;反映坏死性凋亡的指标)和TLR4的表达水平;CCK-8法测定心肌细胞存活率;用试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性;ELISA检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平;双氯荧光素染色法测定细胞内活性氧簇(ROS)水平;罗丹明123染色法测定线粒体膜电位(MMP)。结果:HG(35 mmol/L葡萄糖)作用H9c2心肌细胞24 h可使RIP3的表达水平明显升高,应用30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h可抑制HG对RIP3的上调;另一方面,HG可上调TLR4的表达,100μmol/L坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)和HG共处理心肌细胞24 h可抑制HG对TLR4的上调;而1μmol/L Ang-(1-7)和HG共处理心肌细胞24 h能同时抑制HG对RIP3和TLR4的上调。此外,1μmol/L Ang-(1-7)、30μmol/L TAK-242或100μmol/L Nec-1与HG共处理心肌细胞均能对抗HG引起的心肌细胞损伤,细胞存活率升高,LDH活性降低,ROS生成和MMP丢失减少,同时IL-1β和TNF-α的分泌减少。结论:Ang-(1-7)通过抑制TLR4激活和坏死性凋亡的相互作用对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤。     

麝香保心丸通过抑制p38 MAPK和NF-κB信号传导通路表达对抗高糖诱导的心肌细胞损伤

目的探讨麝香保心丸(SBP)是否通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路保护H9c2心肌细胞对抗高浓度葡萄糖(高糖,HG)引起的损伤。方法应用35 mmol/L的HG处理H9c2心肌细胞24 h,建立HG诱导的心肌细胞损伤模型;细胞计数试剂盒8测定细胞存活率;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定细胞凋亡;双氯荧光素(2’,7’-dichlorfluorescein-diacetate,DCFH-DA)染色/荧光显微镜照相法测定胞内活性氧(ROS)水平;罗丹明123(Rh123)染色法测定线粒体膜电位(MMP);Western blot法测定p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达水平。结果 HG处理H9c2心肌细胞24 h能引起细胞明显的损伤,使细胞存活率降低,凋亡细胞数量和细胞内ROS生成增多,MMP丢失;HG能增加p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平;SBP预处理能明显抑制HG上调p38 MAPK和NF-κB p65磷酸化水平这一作用;SBP、p38MAPK通路抑制剂SB203580和NF-κB通路抑制剂PDTC均能阻断HG对心肌细胞的上述损伤作用,包括细胞毒性、凋亡、ROS生成增多及MMP丢失等。结论麝香保心丸(SBP)可通过抑制p38 MAPK和NF-κB信号传导通路保护H9c2心肌细胞对抗高糖(HG)引起的损伤。     

ATP敏感性钾通道的开放通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症

目的:探讨开放ATP敏感性钾通道(K_(ATP)通道)能否抑制Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。方法:应用Western blot测定TLR4和NF-κB p65的蛋白水平;应用ELISA法检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定心肌细胞存活率;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(MMP);双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内活性氧簇(ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法检测凋亡细胞数量。结果:H9c2心肌细胞经HG(35 mmol/L葡萄糖)处理24 h,胞内TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白水平明显增加,100μmol/L K_(ATP)通道开放剂二氮嗪(DZ)预处理30 min可抑制HG对TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平的上调作用;此外,30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h也可减轻HG对p-NF-κB p65的上调作用。另一方面,100μmol/L DZ预处理有明确的心肌保护作用,可抑制HG引起的细胞毒性、炎症反应、线粒体损伤、氧化应激和细胞凋亡,使细胞存活率升高,并减少IL-1β和TNF-α分泌水平、MMP丢失、ROS生成及凋亡细胞数量;而30μmol/L TAK-242或100μmol/L PDTC(NF-κB抑制剂)共处理心肌细胞24 h也可发挥和DZ相类似的作用,能抑制HG引起的上述损伤和炎症反应。结论:开放K_(ATP)通道可通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗HG引起的H9c2肌细胞损伤和炎症。     

硫化氢通过抑制坏死性凋亡对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

 目的: 探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H₂S)能否通过调控坏死性凋亡(necroptosis)对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤。方法: 应用Western blot法检测心肌细胞内能反映坏死性凋亡的RIP3蛋白和cleaved caspase-3蛋白的水平;细胞计数盒测定心肌细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞的数量。结果: 应用HG(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2心肌细胞3 h、6 h、9 h、12 h和24 h均能明显地上调RIP3蛋白的表达水平,其中24 h时RIP3蛋白水平增加最明显。400μmol/L硫氢化钠(NaHS;为H₂S的供体)预处理或坏死性凋亡的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1;100μmol/L)共处理心肌细胞均能明显地抑制HG对RIP3蛋白表达的上调作用。此外,NaHS预处理或Nec-1共处理心肌细胞均显著地抑制HG引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率升高,ROS生成及MMP丢失减少。另一方面,400μmol/L NaHS预处理心肌细胞能使凋亡细胞数量及cleaved caspase-3表达明显减少。结论: H₂S可通过抑制坏死性凋亡保护心肌细胞,对抗高糖引起的损伤。     

柚皮苷通过抑制瘦素通路对抗高糖引起的心肌细胞损伤*

 目的：探讨柚皮苷能否通过抑制瘦素通路保护H9c2心肌细胞,对抗高糖HG引起的损伤。方法：应用Western blotting法检测瘦素及瘦素受体（LEPR）的表达水平;细胞计数盒（CCK-8）测定细胞存活率;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相测定凋亡细胞的形态及数量的变化;双氯荧光素（DCFH-DA）染色荧光显微镜照相法检测胞内活性氧（ROS）水平;罗丹明123染色法测定线粒体膜电位（MMP）。结果：应用35 mmol/L 葡萄糖（HG）处理H9c2心肌细胞6~24 h能上调瘦素表达,其中9 h时表达最多;HG处理心肌细胞1~24 h也能促进LEPR表达,其中12 h时表达最多;在HG处理心肌细胞前,80 μmol/L柚皮苷预处理2 h能明显抑制HG对瘦素及LEPR表达的上调作用;柚皮苷预处理2 h、瘦素拮抗剂预处理24 h或瘦素受体拮抗剂预处理2 h均能抑制HG引起的心肌细胞损伤,使细胞存活率增多,凋亡细胞数量和胞内ROS生成减少,MMP回升。结论:柚皮苷可通过抑制瘦素通路保护H9c2心肌细胞,对抗HG引起的损伤。     

ERS-GSK-3β信号通路介导高糖引起H9c2心肌细胞坏死性凋亡

目的探讨高糖损伤H9c2心肌细胞过程中,内质网应激(ERS)-糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)通路能否介导H9c2心肌细胞坏死性凋亡的发生。方法 H9c2心肌细胞随机分为正常对照(Control)组、高糖(HG,35 mmol/L葡萄糖)损伤组、4-PBA+HG组、Li Cl(为GSK-3β的抑制剂)+HG组、Nec-1(necroptosis特异性抑制剂)+HG组、4-PBA组、Li Cl组和Nec-1组。应用蛋白质免疫印迹试验测定ERS的2个关键蛋白分子,即葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP),以及GSK-3β、受体相互作用蛋白-3(RIP3)的蛋白水平;采用细胞计数试剂盒8测定心肌细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内活性氧(ROS)水平;ELISA法检测细胞分泌IL-1β和TNF-α的水平。结果 HG作用H9c2心肌细胞可促进GRP78、CHOP和RIP3蛋白的表达,并抑制磷酸化(p)-GSK-3β的表达;50μmol/L 4-PBA(ERS的抑制剂)或10 mmol/L Li Cl预处理心肌细胞60 min均能抑制HG对RIP3蛋白的上调作用;4-PBA预处理心肌细胞也可减弱HG对p-GSK-3β的抑制作用。此外,50μmol/L4-PBA和10 mmol/L Li Cl预处理心肌细胞或100μmol/LNec-1和HG共处理细胞均能对抗HG引起的细胞损伤,使细胞存活率升高,ROS生成减少,IL-1β和TNF-α的分泌水平降低。结论 ERS-GSK-3β通路在HG诱导心肌细胞坏死性凋亡等损伤中起着重要的作用。     

血管紧张素-(1-7)通过抑制GSK-3β通路对抗高糖引起的血管内皮细胞凋亡及炎症

目的探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)通路对抗高糖引起的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及炎症。方法应用高糖(HG,40 mmol/L葡萄糖)处理HUVECs 24 h建立HG损伤细胞模型。应用CCK-8法测定细胞存活率;Western blot法检测蛋白的表达水平;ELISA法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果应用HG处理HUVECs 24 h能引起细胞存活率降低,cleaved caspase-3表达水平和炎症因子(包括IL-1β和TNF-α)分泌水平升高及激活GSK-3β;20μmol/L Ang-(1-7)与HG共处理HUVECs 24 h能抑制HG引起的细胞毒性、cleaved caspase-3表达和炎症因子分泌增多及GSK-3β激活。Mas受体[为Ang-(1-7)受体]抑制剂A-779能减弱上述的Ang-(1-7)的抗细胞凋亡、抗炎症及对GSK-3β的抑制作用;GSK-3β抑制剂能减轻HG引起的HUVECs凋亡及炎症因子分泌增多。结论 Ang-(1-7)/Mas受体轴可通过抑制GSK-3β通路保护HUVECs对抗HG引起的细胞凋亡及炎症反应。     

活性氧与丝裂原激活蛋白激酶通路的相互作用介导高糖引起的心肌细胞损伤

目的探讨活性氧(ROS)与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路的相互作用在高糖损伤H9c2心肌细胞中的作用。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞形态及数量的改变;双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相检测细胞内ROS水平;Western blot测定蛋白质表达水平。结果高糖(35 mmol/L葡萄糖)处理H9c2心肌细胞24 h可引起明显的损伤,表现为细胞存活率下降,凋亡细胞数量及ROS水平明显升高。另方面,高糖可明显地上调磷酸化(p)p38MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)及c-Jun N端激酶(JNK)(为MAPK家族的3个成员)的表达水平。N-乙酰半胱氨酸(NAC,为ROS清除剂)能抑制高糖引起的心肌细胞毒性和细胞凋亡,也能阻断高糖对p-p38MAPK、p-ERK1/2及p-JNK表达的上调作用。此外,p38MAPK、ERK1/2和JNK的选择性抑制剂均能抑制高糖引起的心肌损伤,并能抑制ROS生成增多。结论在高糖损伤H9c2心肌细胞中,存在ROS与MAPK通路的正相互作用,这种相互作用可能在高糖引起的心肌细胞损伤中起着重要的作用。     

硫化氢通过调控瘦素保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤

目的探讨瘦素(leptin)在高糖损伤心肌细胞中的作用及硫化氢(H2S)是否通过调控瘦素保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测细胞存活率;Hoechst 33258核染色检测凋亡细胞形态及数量的改变,双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜照相测定胞内活性氧(ROS)水平;罗丹明123(Rh123)染色及荧光显微镜照相测定线粒体膜电位(MMP);Western blot法检测瘦素蛋白的表达。结果 35 mmol/L葡萄糖(高糖)作用H9c2心肌细胞9h可明显地促进瘦素表达,并引起心肌细胞损伤,表现为细胞存活率降低、凋亡细胞数量和ROS生成增多及线粒体膜电位(MMP)丢失。硫化氢钠(NaHS,为H2S的供体)预处理能抑制高糖对心肌细胞瘦素表达的上调作用。NaHS预处理或瘦素拮抗剂均能保护H9c2心肌细胞对抗高糖引起的上述损伤。结论瘦素参与高糖引起的心肌细胞损伤。外源性H2S可通过抑制瘦素表达保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤。