重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

MAGE-3基因片段真核表达质粒的构建

目的克隆人MAGE-3基因片段，以构建真核重组表达质粒pcDNA3-1-MAGE-3，为制备以MAGE-3基因片段为基础的核酸疫苗及探讨相关的肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法RT—PCR法从肝癌组织制备出含BamHI、EcoRI酶切位点的MAGE-3基因片段，pGEM-TEasy为克隆载体，pcDNA3，1为真核表达载体，采用DNA重组技术，将目的基因先克隆至pGEM—TEasy载体再亚克隆至pcDNA3．1载体上，然后，据氨苄青酶素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、克隆鉴定引物T7／SP6PCR扩增方法鉴定阳性克隆，并对阳性克隆pcDNA3．1-MAGE-3中的插入序列进行DNA测序。结果扩增出了MAGE-3目的基因片段；经蓝白筛选实验、克隆鉴定引物扩增方法鉴定得到重组子pGEM—T—MAGE-3；引物扩增方法鉴定得到重组子pcD—NA3，1-MAGE-3;DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较，结果完全一致。结论成功构建了重组pcDNA3．1-MAGE-3肿瘤核酸疫苗，为肿瘤免疫治疗提供了条件。     

粪肠球菌明胶酶的克隆及原核表达

目的克隆粪肠球菌明胶酶gelE基因并原核表达。方法 gelE基因克隆连接至pGEX-4T-1载体,转化至E.coliBL21诱导表达。结果成功扩增基因并构建gelE-pGEX-4T-1重组质粒,测序无碱基突变,在E.coli中高效表达。结论粪肠球菌明胶酶成功原核高效表达。     

小鼠PRL-3原核表达载体的构建

目的:构建小鼠PRL-3基因的原核表达载体,并在感受态细菌BL21中表达。方法:提取小鼠黑色素瘤B16F10细胞的总RNA,经RT-PCR扩增小鼠PRL-3基因,并将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,阳性克隆经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶解及测序鉴定后,转化感受态细菌BL21,经IPTG诱导表达GST-mPRL-3融合蛋白。结果:获得全长为522bp的小鼠PRL-3基因片段,构建重组质粒pGEX-4T-1-mPRL-3,转化感受态细菌BL21后,经IPTG诱导,表达出分子质量约为46KD的GST-mPRL-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以可溶性形式存在于E.coli BL21的胞质中。结论:成功地构建了原核表达载体pGEX-4T-1-mPRL-3,为抗体的制备筛选和肿瘤的相关研究奠定了实验基础。     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

食管癌相关基因2原核表达质粒的构建与诱导表达

目的：构建食管癌相关基因2（ECRG2）原核表达质粒，在大肠杆菌（E．coli）中诱导表达重组蛋白。方法：用聚合酶链反应法扩增ECRG2基因开放阅读框（ORF），构建表达载体pGDX-4T-1-ECRG2，测序鉴定后转化E．coli（BL21）进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，目的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、Western免疫印迹鉴定。结果：SDS-PAGE测定GSr／ECRG2蛋白分子质量约34ku，Western blot验证出目的蛋白特异表达。结论：ECRG2ORF插入pGEX-4T-1质粒并在E．coli中成功表达。     

粪肠球菌信息素CPD克隆、原核载体构建及表达

目的克隆并原核表达粪肠球菌信息素CPD,为特异性抗体制备及致病机制探索奠定基础。方法 CPD基因克隆,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切连接至pGEX-4T-1载体,测序验证,转化至E. coli BL21诱导表达,SDS-PAGE分析。结果成功克隆并构建CPD-pGEX-4T-1重组质粒,测序显示无碱基突变,在E. coli中高效表达。结论在大肠杆菌中高效表达粪肠球菌信息素CPD。     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的构建和表达

目的构建人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1）基因，并表达GST一^2Gly-hGLP-1。方法用限制性内切酶双酶切载有hGLP cDNA的重组克隆质粒PMD18T simple和原核表达质粒pGEX-4T-1，将GLP-1定向插入原核表达载体pGEX-4T-1^＊中，筛选出阳性克隆。在获得重组hGLP-1基因工程菌的基础上，利用定向突变的技术改造其第2位丙氨酸为甘氨酸，经酶切克隆于pGEX-4T-1^＊中，构建pGEX-4T-1^＊／^2Gly-hGLP-1表达载体。转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果经测序分析，证明^2Gly-hGLP-1已经克隆到pGEX-4T-1^＊中。Western blot证实，该蛋白可被特异性hGLP-1识别。结论成功构建和表达了人胰高血糖素样肽-1突变体原核表达质粒。     

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

重组人表皮生长因子的构建与表达

目的 应用原核表达系统研究提高重组表皮生长因子( rhEGF)产量的方法.方法 用RT-PCR方法克隆hEGF基因并插入表达载体pGEX-4T-1,获得重组的表达质粒pGEX-4T-1-hEGF转化大肠杆菌BL21并筛选得到工程菌株,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导目的蛋白表达,亲和层析纯化rhEGF,MTT法测定活...     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

黑色素瘤抗原-3基因片段真核表达质粒的构建

目的构建真核重组表达质粒pcDNA-3.1-MAGE-3,为制备肿瘤核酸疫苗及探讨相关的免疫治疗提供实验依据.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法从肝癌组织中制备出含BamHI、EcoRI酶切位点的黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)目的基因;pGEM-T Easy为克隆载体,pcDNA3.1为真核表达载体,将目的基因分别先后定向克隆至其上;根据氨苄青霉素(Amp)抗性、蓝白筛选实验、引物T7/SP6PCR扩增方法鉴定阳性克隆,并对其中的插入序列进行DNA测序.结果成功扩增出目的基因;经鉴定得到重组质粒pGEM-T-MAGE-3和pcDNA3.1-MAGE-3;DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较完全一致.结论成功构建pcDNA3.1-MAGE-3肿瘤核酸疫苗,可为免疫治疗提供实验依据.     

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基凶的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Set的编码序列．克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T—1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进-步的工作打下了基础。