人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165腺病毒表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-VEGF165腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-VEGF165腺病毒,并进行电镜观察及滴度测定。感染大鼠骨髓间充质干细胞观察VEGF165基因的转录和表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒含有hVEGF165cDNA,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,测定包装的病毒滴度为6.3×1010TCID50/ml。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及免疫印迹检测骨髓间充质干细胞内有VEGF165的转录和表达。结论构建的VEGF腺病毒表达载体可有效感染骨髓间充质干细胞,并在体外高效表达,为将表达VEGF基因的骨髓间充质干细胞用于基因治疗提供了实验依据。     

携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。     

VEGF165过表达对BMP2成骨细胞分化影响的实验研究

[目的]探讨腺病毒转染血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein 2,BMP2)促成骨细胞分化的抑制性作用研究。[方法]采用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定并作为细胞实验对象,使用Ad-BMP2和Ad-BMP2-VEGF165载体体外转染BMSCs,倒置荧光显微镜下观察GFP表达变化;同时ELISA和Western blot检测BMP2和VEGF165蛋白的表达。然后,应用成骨细胞诱导培养液定向诱导BMSCs向成骨细胞分化。实验分3组:Ad-BMP2-VEGF165转染BMSCs组(Ad-BMP2-VEGF165组),AdBMP2转染BMSCs组(Ad-BMP2组),BMSCs组(对照组)。分别在成骨细胞诱导培养后7、14、21 d,通过Real-time PCR分析ALP和OC mRNA相对表达水平和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、骨钙素(Osteocalcin,OC)免疫组化染色来评价各组BMSCs成骨分化潜能的影响。[结果]第3代细胞表面高表达CD29(99.82%)、CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)、CD34(0.34%);腺病毒转染后第5 h BMP2和h VEGF165蛋白水平表达最高;成骨细胞诱导培养14和21 d后,Ad-BMP2组成骨相关基因表达、OC免疫组化和ALP活性表达最高,结果与其他两组相比较差异具有统计学意义(P<0.05);而对照组表达最弱,与Ad-BMP2-VEGF165组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]腺病毒载体Ad-BMP2与Ad-BMP2-VEGF165转染BMSCs后,均具有明显促进BMSCs体外诱导成骨细胞分化潜能,但Ad-BMP2诱导作用更为显著,同时说明VEGF165可能对BMSCs成骨细胞分化起抑制作用。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165（VEGF165）重组腺病毒，并在293T细胞中扩增。方法将PCR获取的VEGF165基因酶切并插入到pAdTrack-CMV中，构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165，经PmeI酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中，挑选同源重组菌落。提取质粒并用Pac I酶切鉴定，线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞，包装成重组腺病毒颗粒，荧光显微镜下观察绿色荧光表达，并扩增收集重组腺病毒，测定病毒滴度。结果经限制性内切酶检测、基因测序及和绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒，并扩增出10^9pfu／mL的高滴度重组腺病毒。结论成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒载体，为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础。     

hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒载体转染BMSCs复合n-HA/PA66组织工程骨构建及检测

[目的]探讨腺病毒介导共表达人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelia growth factor 165,VEGF165)载体转染兔骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66)体外构建组织工程骨的可行性。[方法]采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定;第3代BMSCs作为细胞实验对象,实验共分2组:Ad-BMP2-VEGF165为实验组和Ad-GFP为对照组;首先用不同感染复数感染BMSCs,并进行ELISA和Western blot检测细胞h BMP2和h VEGF165的表达;其次将感染后的细胞接种到n-HA/PA66生物材料上,7 d后扫描电镜观察细胞贴附、生长状况;同时,7 d后消化收集贴附n-HA/PA66上的细胞,Western blot检测贴附生物材料细胞中骨钙素(osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,以及3 d和7 d后的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定。[结果]第3代细胞表面高表达CD29(99.82%)和CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)和CD34(0.34%);腺病毒感染后h BMP2和h VEGF165蛋白水平高表达;扫描电镜见感染细胞分布均匀,生长状态良好。实验组与对照组相比,复合n-HA/PA66后Western Blot检测显示OC和OPN表达和ALP活性均较高,两组差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]Ad-BMP2-VEGF165双基因腺病毒感染BMSCs后目的蛋白较高量表达,同时感染后BMSCs可以在n-HA/PA66进行良好的黏附、生长、增殖、矿化,Ad-BMP2-VEGF165双基因表达组织工程骨构建成功。     

人BMP-7及VEGF基因共表达腺病毒的构建及在兔骨髓基质干细胞中的共表达

目的:构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达.方法:利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒AdB7V,体外感染rBMSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达.结果:rBMSC经AdB7V感染后72h可观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7及VEGF165基因均可在rBMSC中表达.结论:成功构建人BMP-7及VEGF165基因共表达重组腺病毒,证实了其在rBMSC的表达,为骨再生的局部联合基因治疗打下基础.     

人BMP-7及VEGF基因共表达腺病毒的构建及在兔骨髓基质干细胞中的共表达

目的：构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7及VEGF165基因共表达腺病毒AdB7V，体外感染rBMSC后通过观察绿色荧光蛋白表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达。结果：rBMSC经AdB7V感染后72h可观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达，RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7及VEGF165基因均可在rBMSC中表达。结论：成功构建人BMP-7及VEGF165基因共表达重组腺病毒，证实了其在rBMSC的表达，为骨再生的局部联合基因治疗打下基础。     

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及转染骨髓间充质干细胞的研究

目的 构建骨形成蛋白(BMP)7重组腺病毒，使其转染骨髓间充质干细胞并在细胞内得到表达。方法 将BMP7基因克隆到转移载体pAdTrack—CMV中，在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组，得到BMP7重组腺病毒基因组，通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP7重组腺病毒转染分离纯化后的骨髓间充质干细胞，鉴定BMP7在细胞内的表达。结果 经过多聚酶链反应(PCR)及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒padTrack—BMP7和BMP7重组腺病毒基因组，并包装出重组腺病毒。逆转录PCR和免疫组织化学证明BMP7在重组腺病毒转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。结论 BMP7重组腺病毒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达，为BMP7基因治疗的研究奠定了基础。     

大鼠VEGF腺病毒基因转染系统的构建及鉴定

目的:探讨构建携带大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)的重组腺病毒载体方法，为后续的基因转染研究作准备。方法:采用RT-PCR扩增的方法获取鼠源性的VEGF,并克隆入穿梭质粒pDC316。构建的质粒pDC316-VEGF经酶切及测序鉴定正确后，通过lipofectamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGE3共转染至人胚肾细胞HEK293，经同源重组后获得携带鼠VEGF的重组腺病毒VDC316-VEGF。应用PCR鉴定重组腺病毒，空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠VEGF,病毒滴度为3×109pfu/mL。结论:成功构建的携带大鼠VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作中可靠的基因转染工具。     

VEGF165慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建VEGF165慢病毒包装质粒,通过慢病毒介导VEGF165感染入骨髓间充质干细胞(hBMSCs)并验证其表达情况,为高表达VEGF的HBMSCs应用于血管再生和治疗临床创面愈合提供研究基础. 方法 2012年3月至2013年3月,采用聚合酶链式反应(PCR)从提取的人体组织总RNA逆转录扩增VEGF165,经双酶切后与pLVX-IRES-ZsGreen1真核载体连接,在脂质体介导下将重组质粒转染293T细胞,包装产生的病毒液感染HBMSCs,荧光显微镜下观察VEGF165荧光融合蛋白表达,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测VEGF165 mRNA的表达.对结果用SPSS13.0统计软件进行分析,P＜0.05为差异有统计学意义. 结果 双酶切产物于576 bp处出现特异性条带,测序结果与预期符合,表明所构建重组质粒pLVX-IRES-ZsGreen1+VEGF165结构正确.构建质粒转染293T细胞并产生高滴度含目的基因VEGF165的慢病毒,感染hBMSCs后,细胞在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,qRT-PCR结果显示慢病毒感染组VEGF165 mRNA表达水平为32.27±1.05,显著高于对照组(P＜0.05). 结论 成功构建VEGF165慢病毒包装质粒,并感染hBMSC,为其基因治疗应用于临床提供了依据.     

活骨移植治疗四肢骨肿瘤切除后长段骨与关节缺损

目的:探讨四肢骨肿瘤的广泛或边缘切除后,长段骨关节缺损的修复方法及其疗效。方法:四肢骨肿瘤切除术后骨缺损14例,男10例,女4例;年龄4~37岁。骨巨细胞瘤4例,骨化性纤维瘤1例,非骨化性纤维瘤2例,韧带样纤维瘤1例,骨纤维结构不良3例,侵袭性骨母细胞瘤1例,软骨母细胞瘤1例,瘤样病损致骨溶解1例。14例四肢侵袭性良性骨肿瘤行肿瘤广泛或边缘切除,应用吻合血管的腓骨、带腓骨头腓骨近端和带旋髂深血管的髂骨瓣移植修复骨缺损、重建桡腕关节和重建肩关节。移植体行简单内固定加外固定。术后定期复查X线片、多普勒血管超声,其中3例行ECT核素骨扫描,并作关节功能评定。结果:随访3个月~5年,13例均于手术后3个月后达Ⅰ期愈合,其中1例因内固定松动再次手术而愈合。1例肿瘤局部复发,再次行肿瘤切刮与植骨术后愈合;2例畸形愈合行截骨矫形后愈合。关节功能评定:优9例,良3例,差2例。结论:骨肿瘤切除后行骨移植修复骨缺损、重建关节,手术切除彻底,复发率低,植骨愈合可靠,重建后的关节功能良好。     

深度冷冻大段同种骨的制备及应用

目的：建立现代骨组织库，观察深度冷冻大段同种骨移植的临床效果。方法：采用深度冷冻、物理脱脂、真空包装和辐照灭菌等现代技术处理人类大段骨组织，临床应用24例，包括创伤性肢体骨重建、半侧骨盆重建、半侧骶骨移植、四肢大段骨或骨关节移植等，观察近期临床结果。结果：骨移植材料的无菌检测合格，生物力学强度无明显下降，可远程运输和短期保存．全部病例无明显的免疫排斥反应，成功率为100％.结论：深度冷冻大段同种骨临床使用安全可靠，保存和运输方便.     

冷冻干燥同种骨临床应用的初步报告

目的：建立现代骨组织库，观察系列冷冻干燥同种骨移植的临床效果。方法：采用深度冷冻、真空冷冻干燥和辐照灭菌等现代技术处理人类骨组织，临床应用系列冻干骨94例，包括骨缺损填充、骨不连植骨、脊柱和关节融合、人工关节翻修、髋臼造盖等，观察近期临床结果。结果：冻干同种骨的理化性能、无菌检测和生物性能完全符合体内植入物的相关国家标准，常温下可保存2年。94例中的90例无明显的免疫排斥反应，优良率为95．76％，成功率为97．87％。结论：冷冻干燥同种骨使用安全，保存和运输方便，可替代临床自体骨移植。     

The comparative effects of dichloromethylene diphosphonate (Cl2MDP) and ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate (EHDP) on growth and modeling of the rat tibia

Summary Male rats weighing 100 g were assigned to groups and injected daily for 10 days with vehicle (control), 0.4, 2.0, 4.0, 10.0, or 20.0 mg/kg/day of ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate (EHDP) or dichloromethylene diphosphonate (Cl₂MDP). The proximal tibial metaphysis and epiphysis were assayed for changes in percentage of hard tissue and bone formation parameters. From the data, information about hard tissue resorption was deduced.All doses of Cl₂MDP and doses of 2.0 mg EHDP/kg/day and greater caused significant increases in percentage of hard tissues with Cl₂MDP being more effective than similar doses of EHDP in decreasing bone resorption.Osteoclast population parameters were increased with all doses of both Cl₂MDP and EHDP with Cl₂MDP having a greater effect than similar doses of EHDP. Decreases in the proliferation of the osteoprogenitor pool parallel the decreases in osteoblasts and bone formation parameters. These decreases in osteoprogenitor pool proliferation do not account for the increases with diphosphonates in osteoclast population parameters.     

骨基质明胶复合自体红骨髓及同种异体骨修复骨缺损

目的:评价骨基质明胶复合自体红骨髓及同种异体骨联合移植修复骨缺损的疗效。方法:76例良性骨肿瘤和瘤样病损患者,彻底刮除病灶或作肿瘤骨段切除,并对瘤壁作灭活处理,以同种异体骨作支架,周围填充骨基质明胶和自体红骨髓复合物,术后观察机体反应及骨缺损修复情况。结果:术后机体无明显免疫排斥反应,无1例发生感染,所有病例随访时间为5～16个月,X线显示新骨形成时间为术后1.5～4月,完全骨化的时间为术后5～9月,骨缺损骨性愈合74例,并获得较好的关节功能,肿瘤复发2例。结论:骨基质明胶、自体红骨髓、同种异体骨复合物能有效修复骨缺损,有广泛的临床应用前景。     

外固定架及重组合异种骨植骨治疗胫骨骨缺损与骨不连

目的：探讨外固定架和重组合异种骨(RBX)植骨治疗胫骨骨缺损、伴肢体短缩的胫骨骨不连及先天性胫骨假关节的临床疗效。方法：应用外固定架共治疗胫骨骨缺损、伴肢体短缩性骨不连及先天性胫骨假关节20例。胫骨断端清理后短缩长度2—9cm，平均4．8cm。断端应用RBX植骨12例。结果：20例病人随访8个月-7年，平均4年3个月，患肢功能恢复满意。12例应用RBX植骨治疗骨不连的平均愈合时间4．8个月。结论：本手术方法治疗胫骨骨缺损、伴肢体短缩的胫骨骨不连及先天性胫骨假关节，创伤小、操作简单，肢体功能恢复满意；RBX植骨治疗骨不连，安全，对促进骨愈合疗效可靠。     

Treatment of tibial defect and bone nonunion with limb shortening with external fixator and reconstituted bone xenograft

Objective: To explore the effect of external fixator and reconstituted bone xenograft (RBX) in the treatment of tibial bone defect, tibial bone nonunion and congenital pseudarthrosis of the tibia with limb shortening. Methods : Twenty patients ( 13 males and 7 females)with tibial bone defect, tibial bone nonunion or congenital pseudarthrosis of the tibia with limb shortening were treated with external fixation, Two kinds of external fixators were used: a half ring sulcated external fixator used in 13 patients and a combined external fixator in 7 patients.Foot-drop was corrected at the same time with external fixation in 4 patients. The shortened length of the tibia was in the range of 2-9 cm, with an average of 4.8 cm. For bone grafting, RBX was used in 12 patients, autogenous ilium was used in 3 patients and autogenous fibula was implanted as a bone plug into the medullary canal in 1 case,and no bone graft was used in 4 patients. Results: All the 20 patients were followed-up for 8 months to 7 years, averaging 51 months. Satisfactory function of the affected extremities was obtained. All the shortened extremities were lengthened to the expected length. For all the lengthening area and the fracture sites,bone union was obtained at the last. The average healing time of 12 patients treated with RBX was 4.8 months. Conclusions: Both the half ring sulcated external fixator and the combined external fixator have the advantages of small trauma, simple operation, elastic fixation without stress shielding and non-limitation from local soft tissue conditions, and there is satisfactory functional recovery of affected extremities in the treatment of tibial bone defects, tibial bone nonunion and congenital pseudarthrosis of the tibia combined with limb shortening.RBX has good biocompatibility and does not cause immunological rejections. It can also be safely used in treatment of bone nonunion and has reliable effect to promote bone healing.     

生物活性复合人工骨的制备与理化性能研究

目的探讨硫酸钙/骨基质明胶生物活性复合人工骨的制备方法及其理化性能。方法分别制备硫酸钙、骨基质明胶颗粒,按1：1、2：1、3：1、1：0不同质量比例制备复合人工骨。经扫描电镜观察、生物力学测试及体外降解试验,研究不同配比复合人工骨的结构特征、力学强度及降解速率。结果硫酸钙与骨基质明胶呈均匀混合分布,材料内见较多孔径为100～500μm的微孔结构,孔隙间相互交通,随着骨粒含量的增加,孔径逐渐增大。质量比为1：1、2：1、3：1、1：0的复合人工骨的抗压强度分别为(3．53±0．62)、(6．74±0．78)、(13．60±1．01)、(39．85±2．33)MPa,100%体外降解时间分别为8、10、12、12周。结论硫酸钙/骨基质明胶复合人工骨具有利于新骨长入的微孔结构,随着骨粒含量的增高,材料的力学强度逐渐减低,降解时间加快,不同配比的复合材料可适用于不同的植骨需要。     

骨库移植骨污染及控制

目的：为避免同种异体移植骨的污染，减少感染及交叉感染的危险，总结了全军骨科研究所综合骨库移植骨制备情况，特别是对植骨污染情况进行了调查。方法与结果：自１９９１年９月～１９９７年１２月共得到２８例供体，经系列筛选５例不合格，占１８％，以ＨＢＶ感染者为主。经无菌取骨的大段骨关节细菌污染率仍高达３０％，主要为软组织、骨膜及骨干表面污染，而髓腔内污染少。所染细菌主要为非致病人，６例术后感染，其中大段骨关节     

自体游离骨膜包裹多孔块状HAP修复掌指骨骨缺损的初步临床应用

为研究修复骨缺损的新材料，我们于１９９０年起，应用游离移植骨膜包裹多孔块状羟基磷灰石，修复５例掌指骨骨缺损的患者，手术时应保护好骨膜生发层，ＨＡＰ大小适宜，固定要牢固，经８￣１２个月的随访，均达到骨性愈合，我们认为ＨＡＰ是修复骨缺损的一种新材料，但仍需作进一步研究。