体外培养杂交瘤细胞生产人用鼠源单克隆抗体

<正>目前,人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。体内法即腹水法。尽管腹水中抗体浓度比较高（2～10mg/ml）,但由于所用的BALB/c小鼠必须达到SPF级,繁殖、饲养BALB/c小鼠及生产腹水、纯化抗体的厂房必须符合GMP要求,WHO及我国对体内法生产的人用鼠源单克隆抗体的质检项目繁多,要求严格,因此限制了体内法在人用鼠源单抗生产领域的应用。由于体外法（杂交瘤细胞体外培养法）的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,     

应用生物反应器大规模培养杂交瘤细胞生产体内治疗用WuT3单克隆抗体

用3．5L和14L生物反应器培养WUT3杂交瘤细胞,结果表明用人血清可以代替牛血清培养WuT3细胞,在1％人血清培养液中添加适当营养成分,可达到10％小牛血清浓度下的细胞浓度（1．5×106／ml）和单抗产量（大于50μg／ml）。放大到75L生物反应器中采用半连续方式培养,建立了中试培养工艺流程和质控点,收获时细胞浓度为1.0×106～1．5×106／ml,单抗产量为40～70μg／ml,平均日产单抗达1g。在3．5L、14L、75L逐级放大培养过程中,细胞支原体为阴性,收获上清中单抗免疫活性合格,热原试验合格。     

应用篮式生物反应器培养1A_5杂交瘤细胞及单克隆抗体分泌

目的 为了提高体外培养的杂交瘤细胞单克隆抗体的合成分泌,并为治疗型人源化单克隆抗体生 产摸索条件。方法 应用５Ｌ篮式及非篮式生物反应器培养１Ａ５杂交瘤细胞,以分泌干扰素单克隆抗体,从中对 １Ａ５细胞的接种浓度、反应动态、培养方式等进行研究。结果 细胞最适的接种浓度为２．０×１０５／ｍｌ左右;同非篮式 培养相比,在篮式培养过程中,通过葡萄糖消耗率的监测,及时地调节培养条件及换液时间,延长了培养周期,增加 了每罐收液批次,并且每次是全量换液,最高收液效价为１：４０９６。结论（１）１Ａ５ 细胞分泌干扰素单抗属于负生长 耦连型,葡萄糖消耗率与细胞的生长呈线性关系,可以利用糖消耗率的变化判断篮式生物反应器中细胞生长状况; （２）篮式生物反应器载体培养优于非篮式生物反应器悬浮培养;（３）适当地增加培养基中葡萄糖的量,可以提高干 扰素单抗的合成分泌。     

C50株抗CEA杂交瘤细胞抗体生成动力学及体外培养条件的优化

目的　研究C5 0株抗CEA杂交瘤细胞的抗体生成动力学 ,确定优化体外培养条件。方法　体外静态培养C5 0细胞 ,采用ELISA和细胞计数的方法检测培养上清抗体浓度和细胞数量 ,分析细胞生长与抗体分泌的关联性。采用体内复壮和添加新型免疫增强剂CpGODN的方法 ,尝试恢复长期体外培养的C5 0细胞的抗体生成能力。结果　C5 0细胞的抗体生成动力学为非生长关联型 ,经过体内复壮 ,C5 0细胞体外培养上清中抗体浓度显著提高 ,但活细胞密度或细胞活力均未发生明显变化。在培养基中添加一定浓度的CpGODN ,可以恢复长期体外培养的C5 0细胞的抗体生成能力。结论　根据细胞的抗体生成动力学特征 ,通过调节细胞的生长状态 ,可提高上清抗体浓度。根据抗体基因的组织特异性表达的机制 ,通过优化杂交瘤细胞的体外培养条件 ,能保持细胞正常的抗体生成能力 ,维持细胞高且稳定的上清抗体浓度     

应用转瓶大规模培养杂交瘤细胞生产ABO血型单克隆抗体的工艺

目的建立用转瓶悬浮培养杂交瘤细胞生产ＡＢＯ血型抗原单抗的工艺。方法 在无ＣＯ２条件下, 应从转瓶培养分泌抗人Ａ和Ｂ血型抗原单抗的杂交瘤细胞。结果在适当的ｐＨ、转速和起始密度的条件下,细胞 的生长密度和单抗效价均超过静态培养水平。结论该工艺投资少,操作简便,运行稳定,适于规模化生产。     

牛布氏杆菌抗独特型杂交瘤细胞的悬浮培养研究

牛布氏杆菌抗独特型杂交瘤细胞F9株能稳定地分泌高效价的抗独特型抗体,其Ig类型为IgG2a,并具有抗原“内影象”和良好的免疫原性。该细胞培养在Techne－T104型1．5L细胞培养装置中,最适连续培养条件是pH7．1～7．5;36．5±0．5℃,搅拌速度35～45r／min。在连续悬浮培养时,细胞密度维持在3．2×105～8．2×105／ml,单克隆抗独特型抗体浓度可达1．04mg／ml,培养上清ELISA捕获法效价达1：160。     

简易的杂交瘤细胞载体培养法

在1．0L的搅拌培养瓶内安装一个可转动的不锈钢篮子，内充填8．0g的圆片状聚脂载体Fibra－Cel，杂交瘤细胞r－69B培养在此搅拌瓶中，转动速度为100r／min，结果53.5％细胞固滞在聚脂载体内，细胞浓度和产生抗人r－IFN的单克隆抗体IgG量为常规法的2倍左右。该设备简单，很适用于普通实验室培养杂交瘤细胞，也可以用于培养其他各种类型的人和动物细胞。     

杂交瘤细胞流加培养中葡萄糖和谷氨酰胺的代谢控制

对底物限制的流加培养中杂交瘤细胞HB 58的生长、代谢和单抗生成进行了研究。葡萄糖或 谷氨酰胺限制引起比生长速率下降。葡萄糖限制时,乳酸生成减少,细胞对葡萄糖的得率增 加,乳酸对葡萄糖的得率降低,说明葡萄糖更多地参与三羧酸循环。谷氨酰胺限制时,氨和丙氨酸生成减少,细胞和氨对谷氨酰胺的得率增加,丙氨酸对谷氨酰胺的得率减小,说明谷氨酰胺更多地参与脱氢反应,其有效利用率得到提高。     

无血清培养中杂交瘤细胞的能量代谢特性

在 10L生物反应器中 ,研究杂交瘤细胞C5 0在无血清培养条件下生长和能量代谢的特性。结果表明 ,细胞的比耗氧速率、ATP比生成速率和比生长速率有着相似的过程曲线 ,ATP比生成速率与比生长速率呈线性相关 ,反映了细胞能量代谢与生长之间的密切关系。同时发现 ,耗氧速率 (OUR)能够及时、敏感地反映细胞的代谢活力 ,预示细胞的生长变化。据此提出了利用OUR控制补料速率的初步设想。     

Aqueous Two-Phase Extraction of Monoclonal Antibodies from High Cell Density Cell Culture

Improvements of the upstream process for the production of monoclonal antibodies (mAb) has resulted in mammalian cell cultures with significantly increased cell densities. These high cell density (HCD) broths pose severe challenges for established downstream unit operations due to the increased biomass load. To meet these challenges, aqueous two-phase extraction was examined as a potential method for the clarification, as well as first stage purification of a Chinese hamster ovary expressed mAb with cell densities up to 70 · 10⁶ cells mL⁻¹. A clarification with 99 % yield of mAb and 68 % DNA removal was accomplished, which contributes to enable a foundation to the industrial application of aqueous two-phase extraction for manufacturing of mAb from HCD cultivations.     

WuT3无血清培养上清中单克隆抗体纯化工艺的建立

目的对WuT3杂交瘤细胞生物反应器无血清培养上清中单克隆抗体进行分离纯化,建立中试分离纯化工艺。方法采用两步离子交换层析法结合硫酸铵盐析法分离纯化WuT3单抗。在通过小量试验优化纯化参数后,进行中量试验和中试放大。结果建立的纯化方法可以放大到中试规模,每批投料30000ml培养上清,可收获单抗达1.5g,单抗总回收率大于60%。经分离纯化后,单抗IgG纯度大于95%,采用免疫荧光法检测抗体活性合格。结论建立了一条生物反应器无血清培养杂交瘤细胞大规模分离纯化单抗的工艺路线。     

无血清微载体细胞培养的研究进展

微载体技术能够高效大量地增殖细胞,对于在发酵罐中获得高产量的贴壁细胞具有良好的应用前景。无血清培养克服了含血清培养存在潜在污染源及不利于下游分离纯化等缺点,在生物制品生产中已得到广泛应用。本文就无血清微载体细胞培养需添加的组分,使用的微载体和生物反应器的种类,细胞新陈代谢的情况及应用前景作一综述。     

基于发酵动力学模型的小球藻高密度发酵培养

构建了50 L发酵罐小球藻分批培养动力学模型,采用补料策略高密度发酵培养小球藻,考察了补料发酵过程中碳源的利用情况,采用实时荧光定量PCR技术分析了蛋白质合成关键酶二氨基庚二酸异构酶(dapF)、柠檬酸合成酶(CS)和葡萄糖?6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的基因表达情况. 结果表明,小球藻经补料培养120 h,细胞生物量达106.65 g/L,平均生长速率为0.89 g/(L?h),葡萄糖的细胞得率为0.56 g/g,发酵过程中葡萄糖和尿素浓度对小球藻的dspF, CS和G6PDH基因表达量有重要影响.     

应用U937细胞泡沫化模型检测人血高密度脂蛋白生物学功能

目的 准确检测人血高密度脂蛋白（HDL）的生物学功能。方法 采用U937细胞泡沫化模型，检测HDL逆向转运细胞内胆固醇（Ch）的生理功能。用 Brad Ford方法检测蛋白质（Pro）含量，Ch试剂盒检测细胞内 Ch含量，并比较不同剂量HDL转移出细胞内Ch的量。结果 在一定的HDL浓度范围内相关性好（r≥0．98），重复性高（CV=6．l％），回收率为91．8％－110．5％。结论 该方法能更直观地反映HDL转运胆固醇的功能。且具有使用人源细胞、操作简便和易于推广应用的特点。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

重组大肠杆菌高密度培养的研究进展

重组大肠杆菌实现高细胞密度培养(HCDC),可相应地缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用,从而降低生产成本,达到提高生产效率的目的。本文就影响重组大肠杆菌高密度培养的因素及解决方法、几种应用较广泛的高密度培养技术以及基因工程技术在重组大肠杆菌高密度培养中的应用作一综述。     

人MNS_s血型系统抗N单克隆抗体的研制

应用杂交瘤技术,将 NS-1细胞与完整的红细胞免疫的 BALB/c 鼠脾细胞融合,获得MNS_s 血型系统分泌 IgG 抗 N 抗原的杂交瘤细胞株——10D_6。细胞培养上清效价1∶1024,亲和力7秒,经过8个月以上的连续传代培养,细胞增殖良好,性状稳定,持续分泌高效价,高亲和力,抗N 抗原的单克隆抗体。可作为血型检测的又一标准试剂。     

高致密硅质耐火材料的生产与性能研究

开滦精煤股份有限公司一期建有两座JN60—6型焦炉,其炭化室炉头普通硅砖因周期性温度波动导致硅砖产生裂纹、结构疏松、表面剥落。针对焦炉硅砖损坏情况及焦炉大型化的发展要求,开发高致密硅砖成为亟待解决的问题。