氧化修饰低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡

通过观察凋亡细胞的核形态及特征DNA梯形图谱（DNAladder）．研究了氧化修饰低密度脂蛋白（Ox－LDL）诱导的巨噬细胞凋亡。结果显示：Ox－LDL可引起明显的巨噬细胞凋亡，表现在Ox－LDL处理的细胞核发生固缩，染色体DNA断裂的凝胶电泳图谱呈典型的梯形，正常和乙酰化LDL（N－LDL和AC－LDL）未引起明显的巨噬细胞凋亡。Ox－LDL引起的巨噬细胞凋亡具有浓度和时间效应且与其修饰程度有关，修饰程度越高，引起凋亡越明显．     

XBP1在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡中机制研究

目的探讨X盒结合蛋白1(XBP1)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞凋亡中的机制。方法不同浓度的ox-LDL刺激人巨噬细胞THP-1后,利用Western bolt法检测XBP1表达的变化。ox-LDL刺激THP-1细胞不同时间(6 h、12 h和24 h)后,用Western bolt法检测XBP1表达的变化。利用慢病毒介导的shRNA干扰技术及基因过表达技术,分别构建XBP1基因干扰与过表达的THP-1细胞系后,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹检测干扰或过表达XBP1基因后对ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡的影响。结果用不同浓度ox-LDL处理THP-1细胞,XBP1表达强度随着ox-LDL诱导浓度的增加而增强。用100 mg/L ox-LDL处理THP-1细胞不同的时间,XBP1表达强度出现时间依赖性的增强。用100 mg/L ox-LDL处理THP-1细胞24 h出现细胞凋亡。ox-LDL诱导巨噬细胞,与对照组CHOP mRNA和C-Caspase-3 mRNA相比,THP-1细胞干扰XBP1基因表达后,CHOP mRNA和C-Caspase-3 mRNA表达水平明显增强(对照组CHOP 31.93±0.21,C-Caspase-3 24.16±1.18;干扰组CHOP 48.30±0.53,C-Caspase-3 39.12±2.75;P<0.01)。ox-LDL诱导巨噬细胞,与对照组CHOP mRNA和C-Caspase-3 mRNA相比,当THP-1细胞过表达XBP1基因后,CHOP mRNA和C-Caspase-3 mRNA表达水平明显减少(对照组CHOP 31.53±0.47,C-Caspase-3 22.23±0.63;过表达组:CHOP 14.79±0.51,C-Caspase-3 10.69±0.29;P<0.01)。结论 XBP1在ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡中起保护性作用,并可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。     

衔接蛋白p66shc在雌激素抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨衔接蛋白p66shc在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)诱导的心肌细胞凋亡中的作用及雌激素的干预影响。方法 原代培养SD乳鼠心肌细胞,将心肌细胞分为5组:正常对照组、10-11 mol/L AngⅡ组、10－9 mol/L AngⅡ组、10－7 mol/L AngⅡ组、10－7 mol/L AngⅡ+雌二醇组;经药物干预后应用MTT法测定细胞存活率、流式细胞仪测定活性氧含量和细胞凋亡率、荧光酶标仪检测线粒体膜电位水平、Western blot检测p66shc和磷酸化(p-p66shc)蛋白的表达水平。结果 随着AngⅡ浓度的升高,心肌细胞存活率和线粒体膜电位水平逐渐下降,而细胞内活性氧含量和凋亡率逐渐升高 （P<0.05）;且雌激素预处理可减轻AngⅡ对心肌细胞的损伤 （P<0.05）。AngⅡ可使心肌细胞内p-p66shc和线粒体内的p66shc的表达呈剂量依赖性升高 （P<0.05）,雌激素预处理可减弱AngⅡ对细胞内p-p66shc和线粒体内p66shc表达水平的影响 （P<0.05）。结论 p66shc参与了AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡反应,且雌激素可通过下调线粒体内p66shc的表达而减轻AngⅡ对心肌细胞的损伤。     

氧化低密度脂蛋白循环免疫复合物诱导巨噬细胞胆固醇酯蓄积

目的:探讨氧化、天然低密度脂蛋白循环免疫复合物(Ox -LDL- IC)致动脉粥样硬化作用。　方法:采用人源的氧化、天然LDL与异源的抗载脂蛋白B(apoB)结合制备IC,观察不同浓度的Ox- LDL -IC对小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇酯蓄积和泡沫细胞形成的影响。　结果:氧化、天然LDL- IC均可引起巨噬细胞内胆固醇酯大量堆积,其效果强于Ox -LDL(P<0. 001),而且随剂量的增加而升高,并转化为泡沫细胞;而天然LDL、抗apoB处理的巨噬细胞内未见胆固醇酯的堆积。　结论:LDL- IC可导致巨噬细胞转化为泡沫细胞,参与动脉粥样硬化的形成。     

衰老蛋白p66Shc在糖尿病发生中的作用

p66Shc是一种重要的衰老蛋白,可通过诱导多种类型细胞的凋亡和坏死促使机体老化,它的缺失则增强细胞对活性氧类物质的抗性并延长寿命。最新研究发现p66Shc还与糖尿病并发症的发生存在密切联系,如心脏损伤、内皮细胞功能紊乱等,因此其可望成为糖尿病治疗的新靶点。     

心肾综合征中硫酸吲哚酚对巨噬细胞吞噬氧气型低密度脂蛋白的诱导作用的研究

目的  探讨硫酸吲哚酚（IS）对RAW264.7巨噬细胞吞噬氧气型低密度脂蛋白（ox-LDL）的诱导作用及其作用机制。方法  0、10、50、100、200和400μmol/L IS处理RAW264.7细胞24 h,采用CCK-8法测定RAW264.7细胞存活率,流式细胞术测定RAW264.7细胞的Dil标记氧化型低密度脂蛋白（Dil-ox-LDL）吞噬量。200μmol/L IS处理RAW264.7细胞0、12、24、36和48 h,测定RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量。IS组RAW264.7细胞用200μmol/L IS处理24 h,UO126+IS组RAW264.7细胞以5μmol/L UO126预处理2 h后再200μmol/L IS处理24 h,测定非处理组、IS组和UO126+IS组RAW264.7细胞存活率和Dil-ox-LDL吞噬量,并采用蛋白质印迹法（Western blot）检测在IS刺激15 min时的ERK1/1蛋白表达情况。结果  IS对RAW264.7细胞存活率的浓度效应和时间效应检测中,不同组间比较差异无统计学意义（P >0.05）。Dil-ox-LDL吞噬量与IS浸润浓度及处理时间均呈正相关（P <0.01）。IS组的Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于非处理组（P <0.01）。UO126+IS组的Dil-ox-LDL吞噬量略低于非处理组,但差异无统计学意义（P >0.05）;磷酸化ERK1/2蛋白表达量大幅低于非处理组,差异有统计学意义（P <0.01）。UO126+IS组同IS组比较,Dil-ox-LDL吞噬量和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均呈现大幅降低（P <0.01）。  结论  IS可在体外直接诱导RAW264.7巨噬细胞吞噬ox-LDL,该效应经由活跃MAPK信号转导通路实现,且随IS浓度升高和浸润时间延长而增强。

     

扇贝糖胺聚糖对巨噬细胞氧化修饰低密度脂蛋白的影响

动脉粥样硬化（AS）是缺血性心脑血管疾病的主要病理基础,其形成的确切机制尚未阐明。近年来研究证实氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）通过促进巨噬细胞源性泡沫细胞的形成、诱导调亡、促进血管平滑肌增殖等在AS的形成和发展中发挥着极为重要的作用。因此普遍认为减少体内OX-LDL的生成,能抑制AS的形成和发展。     

Daxx在介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡中的作用

目的 初步探讨Daxx在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡中的作用.方法 通过MTT比色法检测ox-LDL对小鼠源性巨噬细胞(RAW264.7)细胞生长的影响:用AO/EB染色、流式细胞仪和DNA断裂片段分析研究ox-LDL诱导的细胞凋亡.eal time PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达情况.结果 ox-LDL能抑制RAW264.7细胞的生长,抑制作用呈剂量-效应关系;50 mg/L ox-LDL处理RAW 264.7细胞48 h后,AO/EB染色细胞呈凋亡特征性改变,并且DNA断裂片段分析显示电泳图出现梯形条带;流式细胞检测显示相同时间不同浓度ox-LDL(0、12.5、25、50、75 mg/L)处理RAW264.7细胞48 h和相同浓度不同时间(50 mg/L,48、72 h)处理细胞,细胞凋亡率逐渐升高;Real time PCR结果表明不同时间和不同浓度的ox-LDL处理RAW264.7细胞后,Daxx mRNA表达水平呈时间和浓度依赖性增加,其中50 mg/L ox-LDL处理细胞48 h组Daxx mRNA表达最高.结论 ox-LDL有诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的作用,其机制可能与Daxx表达增高从而启动细胞凋亡有关.     

冠心平含药血清对氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响

目的 观察冠心平含药血清对氧化低密度脂蛋白（ oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的调控作用。方法 将RAW264.7巨噬细胞分为对照组,模型组,冠心平含药血清低、中、高剂量组,以80 μg/mL ox-LDL刺激24 h,诱导巨噬细胞泡沫化模型,采用不同浓度冠心平含药血清进行干预。油红O染色观察巨噬细胞内脂滴形成;ELISA法检测巨噬细胞内游离胆固醇（free cholesterol,FC）与胆固醇酯（cholesterol esterase,CE）的表达水平;实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞清道夫受体A（scavenger receptor-A,SR-A）和CD36 mRNA表达水平。结果 冠心平中、高剂量能够显著减少巨噬细胞泡沫化;低剂量显著增加巨噬细胞FC水平（P<0.05）,高剂量显著降低巨噬细胞CE水平（P<0.05）;冠心平高剂量显著增加SR-A mRNA表达水平（P<0.05）,低、中、高剂量均显著增加CD36 mRNA表达水平（P<0.05）。结论 冠心平能够抑制巨噬细胞的泡沫化,这或许是冠心平治疗动脉粥样硬化的潜在机制之一。     

bcl-2在氧化低密度脂蛋白诱导人血管内皮细胞凋亡中的作用

目的 观察氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)对人血管内皮细胞株EA.hy926凋亡的影响,并探讨bcl-2在其中的作用.方法 MTT法检测不同浓度的oxLDL(50、100、150、200 oe/m1)对细胞增殖能力的影响;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测不同浓度的oxLDL对细胞凋亡的影响;RT-PCR、Western blot和免疫荧光细胞化学法分别检测不同浓度的oxLDL对bcl-2 mRNA、蛋白表达及在细胞内表达的影响.结果 oxLDL对EA.hy926细胞形态有明显影响,并能明显抑制EA.hy926细胞增殖能力,抑制作用随处理浓度增加而增大,半数抑制浓度(IC50)约为100ug/ml;不同浓度的oxLDL处理细胞24 h后,与对照组比较,早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡细胞百分比均显著增加(P<0.05);oxLDL能够明显抑制细胞内bel-2 mRNA、蛋白表达及在细胞内的表达水平.结论 6cl-2基因在oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡中发挥重要作用,oxLDL可能通过下调bcl-2的表达促进血管内皮细胞凋亡.     

脂多糖通过p38/MAPK通路对巨噬细胞自噬的调控作用

摘 要:【目的】 观察脂多糖(LPS)对巨噬细胞自噬的影响及p38/MAPK通路在其中的作用?【方法】 体外培养巨噬细胞株RAW264.7,分为对照组?饥饿状态激活自噬组?单纯LPS刺激组?LPS+P38抑制剂(SB203582)组和LPS+mTOR抑制剂(rapamycin)组?将前期构建的载体pcDNA3.1-GFP-LC3,转染RAW264.7,通过荧光显微镜观察各组细胞中自噬体形成情况?qRT-PCR方法检测各组中与细胞自噬相关的基因Atg5,Atg7,LC3-Ⅱ和Bnip3 mRNA表达水平的改变?利用Western blotting检测LC3-Ⅱ?p-P38?P38蛋白在各组中的表达情况,以评价LPS激活巨噬细胞自噬过程中p38/MAPK通路的作用?【结果】 在荧光显微镜下可以观察到自噬在饥饿状态组?LPS+SB203582组和LPS+rapamycin组有明显增强;qRT-PCR检测到自噬相关基因Atg5,Atg7,LC3-Ⅱ,和Bnip3 mRNA的表达在饥饿状态组?LPS+SB203582组和LPS+rapamycin组有明显增强;Western blotting 检测发现p-P38在饥饿状态组?LPS组和LPS+rapamycin组中表达明显升高; LC3-Ⅱ的表达在饥饿状态组?LPS+SB203582组和LPS+rapamycin组中表达要高于对照组和LPS组?【结论】 LPS参与巨噬细胞自噬的调控,除经典mTOR通路之外,p38/MAPK通路是其抑制通路之一?     

p38蛋白激酶在脂多糖诱导肺泡巨噬细胞活化中的作用

目的探讨p38蛋白激酶在脂多糖(LPS)刺激肺泡巨噬细胞激活机制中的作用.方法分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,设正常对照组、LPS刺激组、SB203580干预组(SB203580 LPS组).分别采用免疫组织化学和原位分子杂交方法检测p38蛋白质及其mRNA的表达,用放射免疫分析法检测细胞培养上清TNF-α、IL-8的含量.结果LPS刺激肺泡巨噬细胞p38胞核染色阳性细胞百分比、胞浆p38mRNA的表达以及培养上清TNF-α、IL-8含量显著升高,分别为正常对照组的5.75倍、1.44倍、3.57倍和3.22倍;加入SB203580预处理后,上述指标均较LPS刺激组显著下降,较正常对照组稍高,但差异无显著性.肺泡巨噬细胞p38蛋白质胞核染色阳性细胞百分比及其mRNA的表达与培养上清TNF-α、IL-8含量均呈显著正相关.结论LPS刺激肺泡巨噬细胞释放炎性细胞因子可能是通过p38蛋白激酶介导的,抑制p38的活性可能成为治疗炎症反应的一条新途径.     

氧化铜纳米颗粒经p38和ERK信号通路诱导巨噬细胞自噬性损伤

目的：分析氧化铜纳米颗粒（copper oxide nanoparticles,CuONPs）对Raw264.7巨噬细胞自噬的影响,并探讨调节自噬的相关信号通路。方法：用透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）观察CuONPs的形态特征;利用Raw264.7巨噬细胞进行体外实验;不同浓度梯度的CuONPs处理巨噬细胞24 h,用MTS法检测细胞活力;TEM观察自噬小体的形成情况;自噬小体报告质粒GFP-LC3瞬时转染细胞,激光共聚焦显微镜观察CuONPs处理前后Raw264.7细胞胞质中GFP-LC3蛋白绿色点状聚集情况;利用Western blot检测细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达情况及相关的p38和ERK信号通路磷酸化水平。结果：CuONPs可显著抑制Raw264.7细胞活力,并呈一定的剂量依赖关系（F=35.987,P=0.000）;TEM结果显示,CuONPs颗粒沉积于自噬体;激光共聚焦结果表明GFP-LC3转染细胞后,CuONPs处理组GFP-LC3点状聚集明显多于对照组,此外Western blot结果显示LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平明显呈剂量依赖性上升（F=156.585,P=0.000）,上述结果说明CuONPs能促进巨噬细胞中自噬小体的生成;而且Western blot结果表明10 μg/mL的CuONPs处理细胞,能明显上调p-p38、p-ERK蛋白水平,并呈现时间依赖性升高（p-p38：F=72.899,P=0.000;p-ERK：F=123.300,P=0.000）。结论：CuONPs能抑制细胞活力,并诱导巨噬细胞自噬活化,并且p38和ERK通路可能参与了自噬的分子调控。     

Hedgehog信号通路介导乳腺癌干细胞药物敏感性的研究

【目的】 研究介导乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)药物抵抗的新机制。 【方法】 通过CCK-8 assay和球囊形成实验检测MCF-7细胞和(或)无血清非粘附悬浮培养得到富集BCSCs 的MCF-7 mammosphere(MCF-7 MS)对紫杉醇和盐霉素反应的差异。通过蛋白质印迹、免疫荧光或免疫组化检测MCF-7和MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中Hedgehog(Hh)通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,及紫杉醇或盐霉素处理后表达的改变。进一步应用CCK-8 assay和球囊形成实验考察Hh通路主要配体Shh或SMO抑制剂环巴明对盐霉素或紫杉醇抑制MCF-7 MS细胞增殖作用的影响。此外,动物水平也考察了MCF-7 MS细胞移植瘤内Hh通路活性与荷瘤鼠药物敏感性的关系。而且,在290例临床乳腺癌病理组织中,以免疫组化检测及卡方检验分析了SMO及Gli1的阳性表达与BCSCs特异标记物CD44⁺/CD24-表达的相关性。 【结果】 MCF-7 MS具有BCSCs的CD44⁺/CD24^-/low表型、高表达干细胞标记物OCT4、强的克隆形成能力、强的侵袭迁移能力、强的在体成瘤能力等干细胞特性。MCF-7 MS对紫杉醇不敏感,而对盐霉素高度敏感,不同于MCF-7细胞对紫杉醇敏感,而对盐霉素不敏感。MCF-7 MS细胞及其荷瘤鼠移植瘤中的Hh通路主要因子PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达均明显高于MCF-7细胞。盐霉素可明显抑制MCF-7 MS细胞中Hh通路这些因子的表达,而紫杉醇未见抑制作用,且盐霉素和紫杉醇均对MCF-7细胞中的这些蛋白的表达无抑制作用。进一步发现了Shh激活或环巴明抑制Hh通路分别下调或上调了MCF-7 MS对盐霉素或紫杉醇的敏感性。而且,在荷瘤鼠水平也发现了可抑制MCF-7 MS荷瘤鼠移植瘤生长的盐霉素也抑制了PTCH、SMO、Gli1及Gli2的表达,而对荷瘤鼠移植瘤生长无明显抑制作用的紫杉醇对这些因子的表达也无明显的抑制作用。此外,在临床乳腺癌病理组织中,发现了SMO及Gli1的阳性表达与CD44⁺/CD24^-表达正相关。 【结论】 在细胞、裸鼠移植瘤水平及临床病理组织中,乳腺癌干细胞介导的药物敏感性与Hh通路活性改变相关。     

Caveolin-1在氧化型低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞荷脂过程中的表达

目的观察Caveolin-1在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的巨噬细胞荷脂过程中的表达变化,进而分析Caveolin-1在巨噬源性泡沫细胞形成过程中的作用。方法采用75mg／L ox-LDL与RAW264.7细胞共同孵育不同时间,高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量的变化,建立巨噬细胞荷脂化模型;Western-blot检测Caveolin-1蛋白的表达改变。结果75mg／L ox-LDL与RAW264.7细胞共同孵育48h后,细胞内胆固醇酯／总胆固醇的比值上升至42.3％±5.9％,符合荷脂细胞特征。Caveolin-1的蛋白表达较0h组明显减弱。     

巨噬细胞在牙周炎影响动脉粥样硬化中的作用研究

牙周炎是由菌斑微生物引起的,发生在牙周支持组织的慢性炎症破坏性疾病,是成年人牙齿松动脱落的主要原因。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是最常见的心血管疾病之一,是一种以脂质代谢失衡为病变基础,以血管内膜增厚和斑块形成为主要表现的慢性炎症性疾病。越来越多证据说明在AS斑块中可以发现牙周致病菌的存在,揭示了牙周炎与AS可能存在因果关系,然而两者之间的机制尚不明确。巨噬细胞作为先天免疫系统的重要组成部分,在炎症的发生发展过程中起着重要作用,参与了牙周炎及AS的发生发展。本文以巨噬细胞为切入点,对其在牙周炎影响AS中的作用进行综述,为深刻认识两种疾病的相关关系及炎症机制,寻找新的疾病干预靶点提供方向。     

巨噬细胞TREM2信号通路与动脉粥样硬化的研究进展

动脉粥样硬化是大中动脉的慢性炎症性疾病,是众多心血管疾病的病理生理基础.巨噬细胞通过调节脂质浸润和炎症反应参与动脉粥样斑块的形成和发展.髓样细胞触发受体2(TREM2)是一种单次跨膜的免疫球蛋白超家族跨膜受体,能够增强巨噬细胞吞噬能力并抑制其炎性激活,促进巨噬细胞中的胆固醇流出,抑制其向泡沫细胞的转变.泡沫状TREM2...     

Ghrelin通过JNK信号通路抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞凋亡

【目的】观察体外条件下加入外源性ghrelin对内毒素(LPS)诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383凋亡以及吞噬能力的影响,并探讨JNK(c-Jun N-terminal kinase)信号通路在其中所起的作用。【方法】用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测加入LPS或者ghrelin与LPS共孵育后NR8383的细胞毒性;流式细胞技术、原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡率;Western blot检测JNK、phospho-JNK信号通路蛋白以及cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2凋亡相关分子蛋白的表达;激光共聚焦技术检测巨噬细胞的吞噬能力;使用ghrelin受体拮抗剂[D-Lys-3]-GHRP-6、JNK特异性抑制剂SP600125分别抑制ghrelin受体及JNK激酶的激活。【结果】CCK-8检测结果显示LPS可显著抑制NR8383增殖,而ghrelin可呈浓度依赖性地阻断这种抑制作用;流式和TUNEL检测进一步证实ghrelin可显著降低LPS所致NR8383凋亡作用(P<0.05),而应用ghrelin受体拮抗剂[D-Lys-3]-GHRP-6可以减弱ghrelin的抗凋亡效果(P<0.05);LPS可以激活JNK激酶活性,并改变其下游凋亡相关蛋白的表达,其中促凋亡蛋白Bax以及cleaved caspase-3表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,应用ghrelin可以逆转LPS对JNK激酶的激活,继而下调Bax以及cleaved caspase-3的表达,上调Bcl-2的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05);ghrelin还可以维持LPS持续刺激下NR8383的吞噬能力(P<0.05)。【结论】ghrelin通过下调JNK信号通路的激活抑制LPS诱导的NR8383的凋亡,并维持其吞噬能力。