胚胎干细胞向造血细胞分化的研究进展

0 引言 成熟血细胞和造血干细胞来源的缺乏一直严重阻碍着临床输血和造血干细胞移植的发展,将胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)这一能在体外大量扩增的全能干细胞体外分化为成熟血细胞和造血干细胞有可能解决这些难题。ES 细胞向造血细胞的体外分化也可为阐明哺乳动物造血发育的细胞和分子机制提供良好的模     

造血微环境对造血机能影响的研究进展

造血干细胞（hemopoietic stem cells,HSCs）的造血活性主要由造血微环境＂龛＂所决定,因此掌握造血微环境对造血机能的影响是理解造血功能修复的良好途径。本文就造血微环境对造血机能影响的研究进展进行综述。     

人类胚胎干细胞向造血干细胞分化的微环境研究

目的 探讨胎肝基质细胞和骨髓基质细胞在诱导胚胎干细胞向血液血管干细胞分化中的作用,分析基因表达差异.方法 通过将分化4 d的EBs分别接种到以下两组中:(1)胎肝基质细胞层+细胞因子;(2)骨髓基质细胞层+细胞因子:诱导结束后,流式细胞术检测各组中血液血管干细胞标志KDR阳性细胞数以及造血干细胞标志CD34阳性细胞数,计数细胞分化过程中形成的造血干细胞样的集落数,比较诱导分化效果;收集胎肝基质细胞和胚胎骨髓基质细胞,采用cDNA芯片分析基因表达差异.结果 流式细胞术检测发现,两组中KDR+细胞的比例为分别为:(1.06±0.20)%、(8.8±1.49)%;CD34+细胞比例为分别为:(1.25±0.16)%、(9.19±2.10)%;血岛样集落数量分别为0.9±0.36、10.6±0.63;上述结果均以骨髓基质细胞联合细胞因子诱导方法效率最高.基因芯片(hBMSCs/hFLSCs)中总共有240条基因在骨髓基质细胞中高表达,397条基因的在肝脏基质细胞中高表达.对细胞因子、细胞黏附分子以及细胞外基质蛋白的基凶加以分析,结果发现在hBMSCs高表达的相关的21条基因,推测可能与造血分化相关.结论 人类胚胎十细胞向造血干细胞分化过程中,涉及到细胞与细胞之间的相互作用,相关的细胞因子、细胞黏附分子、细胞外基质蛋白等可能起重要的作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化的研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)及其天麻定向诱导神经细胞后向造血细胞分化的潜能。 方法:建立以亚致死量照射的BALB/C小鼠为受体动物模型,体外扩增的大鼠6～7代MSC为供体细胞,分以 下3组,每组12只进行实验:实验组1(A组),放疗+单纯输注MSC;实验组2(B组),放疗+输注天麻诱导1h MSC,A、B组每只小鼠注射0.3mL含1.5×106cells的无血清培养液。空白对照组,放疗+输注等量无血清培 养液。照射后4h内,分别经尾静脉注射。移植60d后取骨髓(BM)、外周血(PB)、脾(SP)细胞悬液,用流式细 胞仪检测供体大鼠源性CD11a、CD45表达。结果:所有实验小鼠均能存活到2个月,骨髓、外周血、脾细胞悬液 均可检测到低表达的大鼠源性CD11a、CD45。对照组为阴性。A、B两组相互比较,具有显著差别意义(P< 0.05)。结论:MSC及天麻定向诱导神经细胞后具有向造血细胞分化潜能。     

胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的体外诱导

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化诱导的途径和方法,为阐明胰岛β-细胞的发育机制和糖尿病的细胞移植治疗奠定基础.方法将传统的多步诱导法改良为两步诱导法,将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞,并与传统的多步法进行比较.结果经过两步诱导,胚胎干细胞被诱导成了胰岛素分泌细胞,越过了先将胚胎干细胞诱导为神经前体细胞,再进一步诱导为胰岛素分泌细胞的传统模式,使诱导时间缩短,诱导方法简化,所得胰岛素分泌细胞数量与传统方法所得相当.结论多阶段和两阶段诱导均可将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞.     

体外诱导鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导条件下分化为心肌细胞的特征。方法:小鼠胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上增殖培养,先将ESCs悬浮培养形成23d的拟胚体(EBs),再将23dEBs种植到含有TGFβ1的24孔板中进行诱导,以及种植到铺有END2细胞饲养层的24孔板中进行诱导,培养液中同时加入TGFβ1。免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(αActin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。流式细胞仪检测EBs集落心肌细胞的平均分化率。结果:TGFβ1诱导组和TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导组分别有43%,91%(P<0.05)的拟胚体出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白αActin和TnT,以及观察到心肌样超微结构,但在共培养的条件下,自发节律性收缩区域较大,且细胞形态较单一。两诱导组EBs集落心肌细胞平均分化率分别是35%,74%(P<0.05)。结论:TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养对小鼠ESCs向心肌细胞定向分化有协同作用,具有较高的诱导分化率。     

激活Notch对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响

目的:观察Notch信号激活剂Jagged蛋白对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响.方法:小鼠胚胎干细胞用荧光染料DAPI(200 mg/L)标记,在细胞培养的基础上,加入Notch信号激活剂Jagged蛋白(5 mg/L)作用14d.①相差显微镜下观察自发性节律收缩细胞的出现情况;②透射电镜对培养细胞进行超微结构分析;③...     

胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的研究及思路

我们从2001年开始进行胚胎干细胞向肝细胞方向的诱导分化研究，大体分3个阶段：肝细胞在胚胎细胞分化系统中的获得及功能表达；肝细胞分化率的检测及提高；胚胎细胞来源的肝细胞移植在动物急性肝衰竭中的应用。     

胚胎干细胞/诱导多能干细胞向肝细胞诱导分化的研究进展

人胚胎干细胞(ESCs)/诱导多能干细胞(i PSCs)诱导生成的肝细胞为研究肝细胞分化分子机制、肝病细胞模型的建立提供了很好的研究平台,且诱导生成的肝细胞为新药开发、体外研究药物代谢、药物的肝脏毒性及药物间的相互作用提供了很好的细胞来源,有望成为肝细胞移植和生物型人工肝的理想种子细胞来源。但目前ESCs/i PSCs向肝细胞诱导分化过程中,仍存在诱导效率不高及功能较弱等问题,成为诱导来源肝细胞用于基础和临床研究的瓶颈。     

猪造血微环境体外模型对人HSC分化作用的实验研究

目的 研究猪造血微环境对人造血干细胞(HSC)向红系分化的影响.方法 分别抽取健康志愿者骨髓6ml、实验用猪骨髓10ml,分离骨髓间充质干细胞(MSCs),接种DMEM/F12培养基,形成单层贴壁的成纤维样细胞后,作为人、猪造血微环境体外模型.按5×104/ml分别将人脐血CD34 细胞接种于人、猪造血微环境体外模型,以不含MSCs的培养系统为阴性对照,按3U/ml分别加入重组人EPO(rhEPO).于接种10 d后,取悬浮细胞,用流式细胞仪检测人CD71,以CD71阳性细胞率作为CD34 细胞向红系分化的分化率.结果 人MSCs支持下的人CD34 细胞在扩增的同时,(86.15±0.69)%细胞向红系分化;猪MSCs支持下的(82.46±1.46)%人CD34 细胞向红系分化,阴性对照(44.62±1.20)%人CD34 细胞向红系分化(P＜0.01).结论 与阴性对照相比,人/猪造血微环境体外模型均能显著促进人CD34 细胞向红系分化.     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞生成造血集落形成细胞

目的:为观察骨髓内皮细胞务件培养液(mouse bone marrow stromal cell-conditional medium,mBMEC-CM)对鼠胚胎干细胞生成造血集落形成细胞的影响.方法:将鼠胚胎干细胞系D3细胞(embry-onic stem cell line-D3,ES-D3)形成4 d拟胚体(day-4 embryoid bodies,4dEBs),再用mBMEC-CM诱导4dEBs生成高增殖潜能集落形成细胞(high proliferation potential-colony formation cell,HPP-CFC)和红系爆式集落形成单位(burst forming unit-erythroid,BFU-E).以形成造血集落的数量为检测指标,观察mBMEC-CM诱导浓度、天数和诱导生成的细胞数与形成HPP-CFC和BFU-E数之间的关系.结果:形成的HPP-CFC和BFU-E集落数均与诱导生成的4dEBs细胞数呈正相关(HPP-CFC:r=0.916,P＜0.05;BFU-E:r=0.927,P＜0.05),且均随着种入的细胞数(在1×107～4×107/L范围内)增加而呈现相应的增加.当种入的细胞数增加到5×107/L时两种集落数均不再增加.mBMEC-CM诱导浓度(在0～20%范围内)与其诱导生成的HPP-CFC和BFU-E数呈剂量依赖性正相关(HPP-CFC:r=0.909,P＜0.05;BFU-E:r=0.927,P＜0.01).20%浓度mBMEC-CM诱导4dEBs来源的细胞于3,6和9 d形成的HPP-CFC和BFU-E数,以诱导3 d者最高,6 d次之,9 d最低.结论:骨髓内皮细胞条件培养液能促进鼠胚胎干细胞分化为HPP-CFC和BFU-E.     

人类胚胎干细胞向造血细胞的自发分化

目的 研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据.方法 将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、Bmil、Scl、gata2等的表达、流式细胞术检测6、8、10、12 d造血干细胞标志CD34表达,并通过造血集落培养方法检测这些时间点造血集落形成能力,最后将拟胚体制备石蜡切片,免疫细胞化学检测10、12、15、18 dCD45阳性阳性细胞数.结果 造血干细胞早期基因KDR、Bmil在hESCs中有表达,同时该基因随着拟胚体培养时间的延长,在第4～6天开始上调表达;造血干细胞标志性基因Scl,gata2在6～8 d开始表达,并且维持高表达到12 d.流式细胞术检测不同时间点hEBs中CD34阳性细胞数,发现其随时间的延长有增多的趋势,6、8、10、12 d分别为(1.4±0.4)%、(3.4±1.3)%、(5.5±2.2)%、(5.1%±1.7)%;6、8、10、12 d的拟胚体细胞进行集落培养检测形成的集落数在每105个拟胚体细胞中分别为0、7±2、37±11、89±29,P<0.01;集落细胞表达CD45,瑞士吉姆撒染色,可以检测到分叶核粒细胞;免疫细胞化学法对10、12、15、18 d拟胚体进行切片染色,发现在这4 d中可以明显观察到CD45阳性细胞的出现,并随时间的延长而数量增多,分别为:0、40.5±15.09、178.6±55.89、253.0±52.04,P<0.05.结论 在自发向造血细胞分化的过程中经历了 3个阶段:hESCs向胚层特异性细胞分化(前6～8 d);造血干祖细胞扩增期(第8～12天);成熟血细胞大量出现期(15 d以后).     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

胎儿肝脏与骨髓间充质干细胞的分离鉴定

目的：建立胎儿肝脏与骨髓间充质干细胞(MSCs) 的分离培养方法,并对两种来源细胞的生物学特性加以鉴定。方法：取胎龄4或5月水囊引产胎儿肝脏和骨髓,用1.073 g·mL^-1的percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSCs培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,对比两种来源的MSCs增殖及生长特征。 结果：胎儿肝脏及胎儿骨髓MSCs CD29、CD44、CD73（SH-3,4）、CD105（SH-2）、CD166、HLA-ABC阳性,CD35、CD45、HLA-DR阴性,均能成脂肪及成骨诱导分化,随MSCs 数量增加,其对外周血T 淋巴细胞转化的抑制作用增强。结论：胎儿肝脏和骨髓中可成功分离MSCs。     

相互间非接触性共培养对神经干细胞和骨髓基质细胞的影响

目的 观察在神经干细胞培养液下非接触性共培养对骨髓基质细胞和神经干细胞的影响.方法 采用Transwell构建共培养体系非接触性共培养方式培养细胞,进行形态学和免疫化学染色方法观察.结果 共培养组:神经干细胞贴壁、伸出长突起,随培养时间延长,彼此交织成网;免疫组化显示细胞分化为神经元、胶质细胞、少突胶质细胞.骨髓基质细胞则大部分悬浮生长形成大的球状,此球状细胞分化的细胞表达神经元、胶质细胞、少突胶质细胞标志性蛋白.对照组:神经干细胞组细胞仍呈悬浮球状生长;骨髓基质细胞组细胞则部分悬浮生长形成小的球状,部分贴壁生长.结论 在神经干细胞培养液下非接触性共培养,骨髓基质细胞和神经干细胞能相互促进向神经细胞的分化,表明骨髓基质细胞和神经干细胞均可能分泌一些营养因子,为彼此提供一种生存分化的微环境.     

造血基质干细胞的研究Ⅰ.原位骨髓的造血重建

用大剂量电离辐射破坏小鼠一侧肢体的骨髓造血组织,在完整机体调节下,伤肢造血重建很快完成。其重建造血机制,除了目前公认的体内其它未受损伤的造血组织内造血干细胞向伤肢迁徙、定居并增殖外,还有环境因素的作用。本文发现并提出在造血重建过程中,骨内膜或骨质内细胞成分很可能起有重要作用。它提示我们,作为支持造血实质细胞机能的微环境核心成分——基质细胞有可能起源于骨内膜或骨皮质。     

小鼠骨髓间充质干细胞、骨髓单核细胞和胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞的效率比较

目的比较小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、小鼠骨髓单核细胞(BM-MNCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程为诱导性多能干细胞(iPS细胞)的效率。方法用慢病毒LV-ef1a-mOct4-IRES-EGFP、LV-ef1a-mSox2-IRES-EGFP、LV-ef1a-mKlf4-IRES-EGFP和LV-ef1a-mc-Myc-IRES-EGFP感染BMSCs、BM-MNCs和MEFs,通过计算碱性磷酸酶染色阳性克隆数比较这3种细胞重编程为iPS细胞的效率。用胚胎干细胞表面标记检测、胚胎干细胞内源基因检测、拟胚体形成实验和畸胎瘤形成实验验证重编程获得的iPS细胞的多能性。结果起源于小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs的3种iPS细胞均能形成边缘光整的致密克隆,可表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织。但是BMSCs来源的碱性磷酸酶阳性克隆数低于BM-MNCs和MEFs来源的克隆数。结论小鼠BMSCs、BM-MNCs及MEFs均可重编程为iPS细胞,但BMSCs重编程为iPS细胞的效率低于BM-MNCs和MEFs。