丙型肝炎病毒NS3抗原检测现状分析

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染引发的危害严重的传染病,慢性HCV感染影响全球约1.8亿人[1],在中国的感染率为3.2％,约80％的HCV感染者会转化为慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC,简称丙肝),使罹患肝癌的风险增加了6倍.1989年,Choo等[2]成功克隆出HCV的基因组.HCV属于黄病毒科,肝病毒属,单股正链RNA病毒,病毒颗粒直径55～65 nm,基因组大小约为9 600 bp,可编码一个含有3010或3011个氨基酸的多聚蛋白前体.多聚蛋白前体被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,分别为衣壳蛋白C、包膜蛋白E1和E2、p7蛋白、非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[3].目前HCV感染的主要诊断指标为抗HCV和HCV RNA,但二者存在一定局限性.HCV-NS3抗原(HCV NS3 antigen,HCAg-NS3)检测具有早期诊断HCV的价值,并可能作为HCV治疗预后监测的新指标,现将HCAg-NS3检测等相关研究进展综述如下.     

丙型病毒性肝炎的诊断与治疗

1989年美国Choo等应用分子克隆技术,从受感染的黑猩猩血液标本中找到了一个与本病恢复期血清起阳性反应的克隆,命名丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),由其引起的肝炎命名为丙型肝炎(hepatitis C,HC).初步研究表明在电镜下HCV为RNA病毒,其直径为55nm,呈球形颗粒,HCV基因组总长9 416个核苷酸,为单股正链,有一个大的开放读码框架,能编码3 014个氨基酸多肽,基因组的两侧分别为5'和3'端的非编码区,编码区从5'端依次为核蛋白(C)区,包膜蛋白(E)区和非结构(NS)区.后者又分为NS1、NS2、NS6、NS4、NS5、等区,NS1又称为E2/NS1.C区基因编码核壳蛋白,E1E2/NS1编码包膜糖蛋白,两者为病毒结构蛋白,NS2、NS6、NS4、NS5区各自编码不同功能的非结构蛋白,其中NS5编码HCV基因组螺旋酶,NS5编码HCV基因组的复制酶.传染源是急、慢性患者和亚临床感染者.传染播途径主要为输血及血液制品,也可通过血液透析、单采血浆、肾移植、性接触、静脉吸毒、母婴传播等.     

丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是单股正链RNA病毒，属黄病毒科丙型肝炎病毒属。全长约9．4kb，其序列为：341b的5’非编码区(5’URT)，编码3011个氨基酸的长开放读框，约27b的3’非编码区(3’URT)。在病毒复制中，氨基端有三个蛋白(C、E1、E2／NSl)，羧基端有四个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)。由于RNA复制酶的低保真性及缺乏校正功能，HCV呈高度异质性；不同地区，不同患者，甚至同一患者在不同病程中HCV分离株，无论是核苷酸序列，还是氨基酸序列均有显著差异^[1][2][3]。本文就丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义作一综述。     

庚型和丙型肝炎病毒的全长cDNA克隆在体内外的表达与复制

目的：研究HGV和HCV的复制和表达。方法：利用HGV全长cDNA克隆(HGVqz)及HCV1a／1b嵌合体cDNA克隆分别构建表达质粒p3．1HGV和p3.1HCV并转染张氏肝细胞,以HGVqz克隆建立HGV转基因小鼠。分别应用RT—PCR、免疫组化及Western印迹分析病毒正、负链RNA,蛋白表达和剪切。结果：在转染p3.1HCV的张氏肝细胞及HGV转基因小鼠某些组织中可检出相应病毒的负链RNA,但在转染p3．1HGV的张氏肝细胞中未能检出HGV负链RNA。Western印迹在转染p3.1HCV的张氏肝细胞中检测到针对HCV NS3蛋白、相对分子质量约70000的特异性条带,在HGV转基因小鼠某些组织中检测到2条特异性条带,相对分子质量约42000和100000,分别相当于HGV E2蛋白及其剪切中间体。然而,在转染p3．1HGV的张氏肝细胞中检测到针对HGV E2蛋白的特异性条带,其相对分子质量约为310000,相当于HGV整个前体蛋白。结论：HGV的表达与复制在体内、外存在差异。细胞内某些特异性因子在病毒前体蛋白剪切中起重要作用,HGV和HCV前体蛋白剪切所需宿主因子可能存在差异,故两种病毒体外培养时的嗜性细胞株并不完全一致。     

丙型肝炎实验室诊断方法的研究进展

HCV由Choo于1989年从受感染的黑猩猩血液标本中被发现，属黄病毒科。HCV基因组是一单股正链RNA，全长约9500个碱基对（bp），整个基因组只含有一个大的开放阅读框架（ORF）（如图1），根据所编码蛋白功能不同分为结构区和非结构区，结构区基因分为核心区（C区）和包膜区（E区），分别编码核心蛋白和包膜蛋白（E1和E2）及P7蛋白；非结构区（包括NS2、NS3、NS4和NS5基因），分别编码NS2-NS5蛋白。     

形成丙型肝炎病毒负链复制体的相关蛋白的分析

【目的】确定丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS5B以及肝母细胞瘤株HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的特异性结合作用。【方法】用蛋白 核酸紫外交联试验分别检测NS5B以及HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的结合作用 ,用非同源RNA和非同源蛋白作为竞争物分析这种结合的特异性。【结果】NS5B以及宿主细胞内一约 4 5ku的蛋白质 (简称P4 5 )均可与HCV负链RNA 3′末端特异性结合。【结论】NS5B和P4 5是HCV负链RNA 3′末端复制体的两个成分     

HCV NS3解旋酶结构及其解旋机制研究进展

NS3是由HCV编码的大约3 000 aa长度的多聚蛋白的1 027～1 659位aa组成,有丝氨酸蛋白酶,NTP酶及解旋酶活性.其中NS3解旋酶与病毒的复制密切相关[1],本文就近年来HCV NS3解旋酶做一综述.     

形成丙型肝炎病毒负链复制体的相关蛋白的分析

目的：确定丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5B以及肝母细胞瘤株HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA3′末端的特异性结合作用。方法：用蛋白-核酸紫外交联试验分别检测NS5B以及HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA3′末端的结合作用，用非同源RNA和非同源蛋白作为竞争物分析这种结合的特异性。结果：NS5B以及宿主细胞内一约45ku的蛋白质（简称P45）均可与HCV负链RNA3′末端特异性结合。结论：NS5B和P45是HCV负链RNA3′末端复制体的两个成分。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的：筛选并克隆丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）反式激活新型靶基因。方法：以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆，其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，通过序列同源性比对和电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从转染peDNA3．1（-）-NS4A的HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术扩增获得该新基因的全长序列，并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果：该新基因的编码序列全长为963个核苷酸（nt），编码产物由321个氨基酸残基（aa）组成，并测序证实，命名为NS4ATP1，在GenBank中注册，注册号为AY740521。结论：分子生物学技术与生物信息学技术相结合，发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1，为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

登革病毒非结构蛋白NS1在检测和免疫预防中的应用

登革热是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒引起的急性传染病,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,引起广泛流行。登革病毒是一种单股正链的RNA黄病毒,依次编码3种结构蛋白,即包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和衣壳蛋白(C),和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5),NS1蛋白在病毒感染、复制及病理过程中起着重要作用。本文就NS1蛋白在登革病毒检测及免疫预防方面的研究进展作一综述。     

丙肝病毒NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体的构建

目的通过克隆丙肝病毒非结构蛋白NS3-4A基因,构建表达HCV-NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体。方法设计合成HCV NS3-4A基因全长的特异性引物,应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增非结构蛋白区NS3-4A基因片段,经限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切后克隆到pFastbacDual上,并转化到大肠杆菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果扩增得到的基因片段长度为2.2kb,该片段成功克隆在杆状病毒穿梭载体pFastBacDual上,经测序证实为HCV NS3-4A基因,这表明HCV-NS3A基因重组杆状病毒穿梭载体构建成功。结论成功构建了表达HCV NS3-4A基因的杆状病毒穿梭载体,这将为下一步HCV杆状病毒载体疫苗的制备打下基础。     

HCV2a(JFH1)NS5A蛋白在原核和真核细胞中的表达、鉴定及分析

目的在原核与真核细胞中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)2a型JFH1(japanese fulminanthepatitis 1)株NS5A蛋白,分析JFH1NS5A蛋白与其它基因型NS5A蛋白间的差异,为进一步研究NS5A蛋白在HCV病毒复制中的作用奠定基础。方法PCR特异扩增JFH1NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1载体中,构建JFH1NS5A的原核和真核重组表达质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。将pET-JFH1NS5A转化大肠杆菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1NS5A转染HEK293T细胞,在原核与真核系统中进行表达,并以SDS-PAGE、荧光显微术和Westernblot方法检测。利用PubMedBLAST软件对JFH1与HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白间的同源性进行了分析。结果酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。SDS-PAGE电泳检测到融合蛋白在原核细胞中的表达,荧光显微镜观察和Westernblot检测到了GFP-JFH1NS5A融合蛋白在HEK293T细胞中表达。BLAST分析显示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分别为57%、60%、68%和74%。结论JFH1NS5A蛋白在原核与真核细胞中表达成功,为研究HCVNS5A在JFH1株病毒高效复制中的作用提供了材料。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达

目的在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后,构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后,再用痘苗病毒vTF7-3株感染,培养48 h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果Western blotting结果表明,在细胞中检测到相对分子质量为70 000 (NS3)和58 000 (Ns5a)的两条带;免疫荧光试验结果表明,无论采用抗NS3 单抗还是抗NS5a 单抗,大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。     

禽流感病毒H9N2的研究进展

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AN)引起的禽类传染病，以引起禽类的呼吸系统疾病和全身败血症为特征，几乎所有的野生及家养禽类都可感染。禽流感病毒属于正粘病毒科的甲型流感病毒。其基因组为单股负链RNA，由8个RNA节段构成，分别编码10个基因产物，包括PBl、PB2、PA多聚酶、HA、NP、NA、M1、M2和NS1、NS2蛋白。依其外膜血凝素抗原HA和神经氨酸酶抗原NA的不同，     

丙型肝炎病毒实验室检测技术的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是一种主要经血液传播的肝炎病毒,是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要病原之一。HCV属于黄病毒属,为单股正链的RNA病毒,基因组长度约9.6kb,含有单个开放阅读框架(ORF),编码一个由约3010个氨基酸组成的多聚蛋白。到目前为止,丙型肝炎的实验室检测技术主要有抗-HCV检测、HCVRNA核酸扩增检测、HCV核心抗原的检测三种类型。现就HCV实验室检测的研究现状作一综述,为致病机理的研究及抗HCV药物的开发和疫苗的研制等提供理论依据。     

丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达

目的 在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法 将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后，构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后，再用痘苗病毒vTF7-3株感染，培养48h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果 Western blotting结果表明，在细胞中检测到相对分子质量为70000(NS3)和58000(NS5a)的两条带；免疫荧光试验结果表明，无论采用抗NS3单抗还是抗NS5a单抗，大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论 HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。     

EV71病毒感染的防治研究

人肠道病毒71型（human enterovirus 71，EV71）属于小 RNA 病毒科（picornaradae）肠道病毒属（ entero-virus）［1］。EV71病毒颗粒为二十面立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径约为30 nm。病毒基因组为单股正链 RNA，全长7413 bp，基因组中仅有一个开放阅读框（ ORF），在其两侧为5＆#39;和3＆#39;-非编码区（UTRs），3＇非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴（poly - A）。病毒基因组编码2194个氨基酸，主要有 P1、P2和 P3这3种前体蛋白，P1前体蛋白被蛋白酶切割为 VP1、VP2、VP3和 VP4这4个病毒外壳蛋白，为组成病毒颗粒的结构蛋白；P2和 P3前体蛋白则被切割为7个有活性的功能蛋白，负责病毒RNA 的复制与蛋白组装［2］。病毒颗粒的衣壳由60个亚单位构成，每个亚单位由 VP1~ VP4拼装成五聚体样结构，其中 VPl 蛋白是最主要的衣壳蛋白，具有最多的型特异性中和位点，与病毒血清型相关性高，是EV71主要的中和决定因子，直接决定病毒的抗原性，成为 EV71基因分型和遗传进化分析的重要研究对象［3］，曾被多次报道用来研制病毒疫苗［4］。     

病毒中具有抗肿瘤作用的编码蛋白

溶瘤病毒可以选择性地诱导肿瘤细胞死亡,除病毒的大量复制、突破细胞膜而直接破坏肿瘤细胞以外,病毒产生的某些特殊蛋白也具有一定的抗肿瘤活性,如腺病毒编码的E4orf4、自主性细小病毒NS1、鸡贫血病毒编码的凋亡素(apoptin)等。不同的病毒编码蛋白所具有的抗肿瘤作用机制不尽相同。进一步了解具有抗肿瘤活性的病毒蛋白的作用机制及特点有助于开发新的抗肿瘤药物。文中就病毒编码蛋白的抗肿瘤作用机制、特点及相关进展作一综述。