核糖核酸酶A在丁酸十二铵-环己烷反胶束溶液中的催化动力学

研究了核糖核酸酶A(RNaseA)在丁酸十二铵(DAB)-环己烷反胶束溶液中催化水解胞苷2',3'-环单磷酸酯的动力学,数据符合Michaelis-Menten酶催化机理.以k_cat/K_m表示酶催化活性时,Rnase A在反胶束溶液中的催化活性是在水溶液中的14～30倍.无论是固定DAB浓度还是固定H₂O与DAB浓度之比,随增溶水量的增加,k_cat/K_m呈下降趋势.     

细胞色素P450 Kemp消除酶的改造及新型催化机制解析（英文）

传统的Kemp消除反应可以通过氢氧化钾和三烷基胺等碱性物质,催化底物苯并异恶唑开环生成产物2-氰基苯酚.三十年来, Kemp消除反应一直被用作模式反应来设计或定向进化新型生物酶催化剂,从而揭示未知的酶催化机制的复杂性,增强对酶催化机制的理解.目前科研人员使用不同的蛋白作为骨架设计能够高效催化Kemp消除反应的人工酶.例如Hilvert及Mayo等基于人工酶HG3.17,设计获得了Kemp消除酶,可以催化5-硝基苯并异恶唑生成产物2-氰基-4-硝基苯酚.通过17轮定向进化获得的最终突变体展现出与天然酶相近的催化活性(k_cat/K_m=230000 L mol^-1 s^-1; k_cat=700 s^-1).该研究不仅表明蛋白质工程可以进化出高效的生物酶,量子力学/分子力学(QM/MM)分析还揭示了突变体催化活性提高的分子机制.与酸碱催化的Kemp消除反应不同,最近Korendovych等报道以肌红蛋白作为骨架基于氧化还原机制的Kemp消除反应,通过开发一种独特的基于...     

D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。 本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。 通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)浓度、NH₄⁺浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD⁺、0.5 mol/L NH₄⁺的条件下、30 ℃,反应12 h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。     

电子转移途径中芳香族氨基酸的引入提高了细胞色素P450s的催化性能（英文）

细胞色素P450s是用于生物合成的多功能催化剂.在P450催化循环中,需要两个电子来还原血红素铁,并通过电子转移途径(eTPs)激活随后的还原,该步骤是反应的限速步骤.本文重新设计了巨大芽孢杆菌P450 BM3的e TPs,大幅提高了其催化性能.通过在P450 BM3的e TP中引入芳香族氨基酸,“最佳”变体P2H02(A399Y/Q403F)的催化效率比P450 BM3野生型催化效率提高了12.9倍(k_cat/K_M从65.8 L mol^-1 s^-1提高到913.5 L mol^-1 s^-1).分子动力学模拟和电子传递分析表明,在辅因子FMN和血红素之间引入的芳香族氨基酸可以显著提高电子转移速率和酶催化性能.同时,在电子传递途径中引入酪氨酸可以保护P450的催化中心,使其避免被氧化性中间产物所破坏,从而提高其催化效率.此外,引入芳香族氨基酸的策略被证明对其他P450(如CYP116B3)同样有效,改造后的酶表现出显著提高的催化效率.综上,本文策略有望拓展到其...     

羰基还原酶辅酶结合域位点突变对其不对称催化性能的影响

基于同源模型的比较和分析,发现羰基还原酶SCR1辅酶结合域P124和W125位点对辅酶NADPH的结合形成了一定的空间位阻效应.通过对该位点进行小侧基氨基酸的取代突变,该酶的底物专一性和立体选择性均发生了不同程度的改变,表明该位点是酶与辅酶有效结合的关键位点,而且它与辅酶结合的空间效应进一步影响了底物结合域活性中心对不同构型的底物及其对映体产物的亲和作用.在底物专一性方面,野生型酶对2-羟基苯乙酮和2-溴苯乙酮及其衍生物等底物表现出较高的催化活性,而突变株W125A,W125G,P124A/W125A和P124G/W125G对苯乙酮及其部分衍生物和2-辛酮等底物的催化活性均有所提高.对于酶的立体选择性,部分突变株发生了转化产物对映体构型反转的现象,突变株P124A/W125A和P124G/W125G催化还原2-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯均生成了(R)-型产物.     

二甲基亚砜和四氢呋喃对胃蛋白酶催化动力学和分子光谱的影响

为了研究二甲基亚砜(DMSO)和四氢呋喃(THF)对胃蛋白酶(Pepsin, PP)催化活性的影响及其作用本质, 测定了在这两种有机溶剂的作用下胃蛋白酶的催化活性、 动力学参数、 紫外吸收光谱、 紫外差示光谱和荧光发射光谱的变化. 结果表明, 体积分数为9%的DMSO使PP活性提高83.4%; 而体积分数为1%的THF只能使PP活性提高3.59%. 在盐酸溶液中, PP的动力学参数K_m=2.22 mg/mL, v_max=1.1×10⁶ U/mg Pro; 在9%DMSO中, 其K_m=1.50 mg/mL, v_max=0.5×10⁶ U/mg Pro; 在1%THF中的K_m=1.91 mg/mL, v_max=0.51×10⁶ U/mg Pro. 9%DMSO强烈抑制PP分子肽键的紫外吸收, 而对芳香族氨基酸无影响; 1%THF则对PP的紫外吸收光谱影响不大. 9%DMSO和1%THF都使PP的紫外差示光谱出现明显的负吸收峰和正吸收峰. 9%DMSO使酶分子的荧光发射峰向短波方向移动1 nm; 而1%THF则对其无影响. 实验结果表明, 在9%DMSO和1%THF中, PP分子的立体构象发生了变化, 使酶分子的K_m下降, 酶分子对底物的亲和力有所升高, 从而导致酶分子的催化活性有不同程度的提高.     

具有GPX活力的抗体片段Fv的制备和性质

具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的鼠抗体3H₄(IgM)经胃蛋白酶水解,产生分子量为25000的抗体Fv片段,用荧光滴定法测定了它与GSH的亲和常数K_a=1.17×10₇L/mol.该片段经苯甲基磺酰氟活化,再经NaHSe作用,其结合部位的丝氨酸被突变为谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化基团硒代半胱氨酸.突变后的Fv片段表现出很高的GPX活性,其活力高达2500U/μmol,称为Fv抗体酶.动力学分析表明,Fv酶的最适温度为55℃,最适pH为7.0,催化机制为乒乓机制,米氏常数分别为:K_m(GSH)=4.16×10^-3mol/L,K_m(H₂O₂)=2.8×10^-4mol/L.     

Lu(La)2O3微米晶中提高Bi3+离子下转换蓝光发光性能的研究

采用尿素沉淀法制备一系列Bi³⁺/La³⁺共掺Lu₂O₃和Bi³⁺/Lu³⁺共掺La₂O₃微米晶。在掺杂Bi³⁺离子的Lu₂O₃微米晶中,C₂位点的Bi³⁺离子可以将吸收的能量转移给S₆位点的Bi³⁺离子。同时,在Lu₂O₃:1%Bi³⁺,0～5%(摩尔分数,下同)La³⁺微米晶中,372和337 nm(C₂和S₆位点的Bi³⁺离子)紫外光的激发下,Bi³⁺离子的发射峰强度随着La³⁺离子掺杂浓度的增加而增加,掺杂5%La³⁺时与不掺杂La     

紫外光谱法实时测定腈水合酶的催化动力学

采用紫外光谱法研究了腈水合酶催化丙烯腈水合的过程,在不同丙烯腈初始浓度下,测定了催化过程中275nm紫外吸光度的变化,计算出丙烯酰胺的生成速率.用Michaelis-Menten方程对不同丙烯腈浓度下的Nocardiasp.腈水合酶催化速率进行了拟合,得到该酶以丙烯腈为底物的米氏常数(K_m)为8.46mmol/L,单位质量腈水合酶的催化速率常数(k_cat)为2398μmol/(min·mg).     

亮氨酸脱氢酶催化底物偶联法合成 α-酮异己酸

构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系, 打破氧化脱氨反应平衡, 同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸, 并实现辅酶NAD⁺的高效循环再生. 基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数, 考察了不同酮酸底物对于底物偶联反应效率的影响, 选择转化率最高的2-丁酮酸作为偶联底物, 使α-KIC产率由单步氧化反应的2.75%提高至66.82%. 通过考察底物浓度、 pH值、 N{\mathrm{H}}_4^{+}浓度和辅酶NAD⁺浓度等反应条件对偶联反应效率的影响, 使α-KIC产率进一步提高至83.25%, 同时辅酶NAD⁺的总转化数(TTN)达到5.88×10⁵. 通过改变底物L-亮氨酸和2-丁酮酸的摩尔比, 能够将α-KIC的产率进一步提高至92.74%.     

Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redox system

Three new nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) analogs were synthesized,and their characteristics as cofactors for Escherichia coli malic enzyme(ME) and its double mutant ME L310R/Q401C were analyzed.Each pair of the NAD analog and the double mutant showed good orthogonality to the natural pair of NAD and ME in terms of catalyzing oxidative decarboxylation of L-malic acid.Results indicated that molecular interactions between redox enzyme and cofactor could be further explored to generate new bioorthogonal redox systems.     

Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamide flucytosine dinucleotide

Many enzymes catalyzing biological redox chemistry depend on the omnipresent cofactor, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). NAD is also involved in various nonredox processes. It remains challenging to disconnect one particular NAD-dependent reaction from all others. Here we present a bioorthogonal system that catalyzes the oxidative decarboxylation of l-malate with a dedicated abiotic cofactor, nicotinamide flucytosine dinucleotide (NFCD). By screening the multisite saturated mutagenesis libraries of the NAD-dependent malic enzyme (ME), we identified the mutant ME-L310R/Q401C, which showed excellent activity with NFCD, yet marginal activity with NAD. We found that another synthetic cofactor, nicotinamide cytosine dinucleotide (NCD), also displayed similar activity with the ME mutants. Inspired by these observations, we mutated d-lactate dehydrogenase (DLDH) and malate dehydrogenase (MDH) to DLDH-V152R and MDH-L6R, respectively, and both mutants showed fully active with NFCD. When coupled with DLDH-V152R, ME-L310R/Q401C required only a catalytic amount of NFCD to convert l-malate. Our results opened the window to engineer bioorthogonal redox systems for a wide variety of applications in systems biology and synthetic biology.     

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)类似物的合成及性质

合成了3种新型结构稳定的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)类似物并通过~1H NMR、~(13)C NMR、~(31)P NMR和HRMS进行了表征。NAD~+类似物经80℃加热24 h后,通过~1H NMR确认其结构稳定;通过循环伏安法(CV)测定了其电化学性质,表明其仍然具有良好的氧化还原性能。     

具有cGPX活力的含硒抗体酶的酶学及动力学性质研究

通过单克隆抗体制备技术得到三株特异结合半抗原4(GSH-S-DNP二苄酯)的单克隆抗体HB4,HB5和HB7.抗体经两步化学诱变得到具有细胞谷胱甘肽过氧化物酶(cGPX)活性的含硒抗体酶mHB4,mHB5和mHB7,活力分别为170,1867,32U/μmol.其中mHB5的活力是天然兔肝cGPX的0.32倍,m4A4的1.51倍.等离子体-质谱(ICP/MS)测得每分子含硒抗体酶分子中大约存在2个硒原子.mHB5的最适pH为8.6～8.8.在pH值范围为7.0和37℃条件下,mHB5催化GSH和H₂O₂或t-ROOH反应的二级速率常数为:_k+1(H₂O₂)9.71×10⁶L/(mol·min),_k+1(t-ROOH)5.99×10⁵L/(mol·min).mHB5使非酶催化反应速率提高了9.8×10⁶和3.7×10⁵倍.     

亚铁金属有机层的合成、结构及其超快仿生催化性能

六水合四氟硼酸亚铁、三水合四氰基铂酸钾和4-甲基吡啶-N-氧化物在水和乙醇中自组装形成了一种新的二维金属有机框架(Fe-MOF).单晶结构分析表明,Fe-MOF结晶于单斜空间群P21/c.在Fe-MOF中,每个[Pt(CN)4]2-通过氰基桥联4个Fe原子,而每个Fe原子与4个[Pt(CN)4]2-的 N相连形成二维(...     

Selective enzyme amplification of NAD/NADH using coimmobilized glycerol dehydrogenase and diaphorase with amperometric detection

A flow system for substrate recycling of NAD⁺/NADH was set up with an enzyme reactor containing coimmobilized glycerol dehydrogenase (GDH) and diaphorase. The product from the diaphorase catalysis, hexacyanoferrate(II), aws detected amperometrically at a glassy carbon electrode. The amplification factor was 150 for a reactor volume of 100 μ l at a flow-rate of 0.5 ml/min. With a stopped flow of four minutes, the signal increased another 88 times, resulting in a signal amplification of 13 300 times. Equations are derived for the amplification factor and used for a discussion of the optimization of amplification systems. The K_m for GDH with glycerol as a substrate was found to be 5 × 10⁻³ M at pH 8.0. GDH from Cellulomonas sp. was purified on a gel filtration column and the purified enzyme showed a specificity toward NAD⁺, compared to NADP⁺, that was higher than 99.9%. Due to the NAD⁺ specificity of the purified GDH, the enzyme amplification system reported here could be used in detection systems for enzyme immunoassays when using alkaline phosphatase as a label and NADP⁺ as a substrate. The stability of immobilized GDH and diaphorase is several orders of magnitude better than that of alcohol dehydrogenase, which is the enzyme commonly used for NAD⁺-specific detection in these applications.     

酶促反应抑制动力学的微量热法研究──氟离子对漆树漆酶催化氧化邻苯二胺的抑制

提出一个适合各类可逆性抑制的热动力学方程,并根据各量之间的关系提出了可逆竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制的热动力学判据以及计算表观米氏常数K_m,app和抑制常数K_i等酶促反应生化常数的热动力学公式,并实际应用于NaF对漆树漆酶催化氧化邻苯二胺抑制的微量热法测定。实验初步得出此抑制为非竞争性抑制,求出其K_m,app、K_i值。     

Study on the Interaction and Properties of Cucurbit[8]uril with Oroxin B

The interaction between cucurbit[8]uril(Q[8]) and oroxin B(ORB) was investigated by UV-visible(UV-Vis) spectroscopy, isothermal titration calorimetry(ITC), mass spectrum(MS) and nuclear magnetic resonance(NMR) spectroscopy. The results showed that ORB formed a 2:1 inclusion complex with Q[8] with a binding constant of 8.266×10⁵ L²·mol^-2. ORB had good scavenging ability for 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)(ABTS) free radicals(IC₅₀=5.74 μmol/L) and the addition of Q[8] did not significantly affect the antioxidant activity of ORB(IC₅₀=5.76 μmol/L). A phase solubility experiment revealed a 1.86-fold increase in the solubility of ORB when c(Q[8])=100 μmol/L. In vitro drug release experiments showed that the release rate for ORB@Q[8] complex was lower than that of ORB in artificial intestinal juice, and higher than that of ORB in artificial gastric juice.     

利用人工氧还酶体系催化L-苹果酸氧化脱羧反应

利用含人工氧还酶体系的粗酶液代替纯酶催化反应,以省去酶分离纯化过程.由苹果酸酶突变体ME-t(MEL310R/Q401C)和非天然辅酶烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD+)组成的人工氧还酶体系可以催化氧化L-苹果酸生成丙酮酸,并得到非天然辅酶的还原态(NFCDH).利用含人工氧还酶体系的粗酶液催化反应,只得到单一产物丙酮酸,其选择性与纯酶催化的相同.来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX)可再生NFCD+.与含NAD+,ME粗酶液和NOX粗酶液的偶联反应体系相比,含NFCD+,ME-t粗酶液和NOX粗酶液的体系获得的丙酮酸产率高9%,而副产物乳酸明显减少.可见人工氧还酶体系使用更方便,且产物选择性更高,有望代替纯酶催化反应.这为降低生物催化剂的成本,扩大生物催化反应的应用提供了一种新的策略.